[發明專利]雞環RNAChr26:2670958|2679178的檢測引物、方法及應用

在審

• 申請號: 201810020111.7
• 申請日: 2018-01-09
• 公開（公告）號: CN107988404A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 李顯耀;鄭林娜;劉麗英;王園美
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 夏艷

1.一種雞環RNA Chr26:2670958|2679178的檢測引物，其特征在于，包括雞環RNA Chr26:2670958|2679178環狀上游引物和雞環RNA Chr26:2670958|2679178環狀下游引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.一種雞環RNA Chr26:2670958|2679178的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、待測樣本RNA的提取；

步驟2、進行反轉錄得到cDNA；

步驟3、用權利要求1中所述的引物，對待測樣本cDNA進行定量PCR擴增，得到PCR擴增產物；

步驟4、采用方法計算基因相對表達量，具體計算公式如下：

△CT＝CT_目的基因-CT_GAPDH，△△CT＝△CT_目的基因-△CT_參照基因；

其中，△CT代表所需驗證基因的CT值減去內參基因的CT值；

CT_目的基因代表所需驗證基因的CT值；

CT_GAPDH代表內參基因的CT值；

△△CT代表目的基因的△CT值減對照組目的基因△CT的平均值；

△CT_目的基因代表目的基因的△CT值；

△CT_參照基因代表對照組目的基因△CT的平均值；

步驟5、根據PCR擴增產物及基因相對表達量判斷待測樣本是否含有環RNA Chr9:10814512|10838667基因及其表達情況。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟1中的待測樣本RNA的提取具體為：采用Trizol法提取樣品總RNA，抽提所得總RNA經安捷倫生物分析儀2100和Qubit 2.0進行質檢。

4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟2中的待測樣本cDNA的提取具體按照以下步驟實施：選擇腸炎沙門氏菌陰性個體，通過口服方法接種腸炎沙門氏菌，接種量為10⁷-10⁹cfu/只，接種后第7天，取盲腸內容物，利用平板計數法測定細菌含量。采取盲腸組織樣，提取RNA，并用RNase R對提取的RNA進行處理，消化掉線性RNA，進行反轉錄生成cDNA。

5.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟3中的定量PCR反應體系如下：2x SYBR Premix Ex TaqTM 10μL，10μM雞環RNA Chr26:2670958|2679178環狀上游引物0.5μL，10μM雞環RNA Chr26:2670958|2679178環狀下游引物0.5μL，待測樣本cDNA 2.0μL，dH₂O 7μL，以上總體積為20μL。

6.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟3中的定量PCR擴增條件為：95℃，30s；95℃，5s，59℃，30s，40個循環；95℃，1min；61℃，30s；95℃，30s，1個循環。

7.權利要求1所述的雞環RNA Chr26:2670958|2679178的檢測引物在檢測雞抗腸炎沙門氏菌感染中的應用。

8.權利要求2-6所述的雞環RNA Chr26:2670958|2679178的檢測方法在檢測雞抗腸炎沙門氏菌感染中的應用。