[發明專利]一種氯噻啉生物發光側流免疫層析方法

在審

• 申請號: 201810016879.7
• 申請日: 2018-01-04
• 公開（公告）號: CN108562741A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 王鳴華;華修德;丁園
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種氯噻啉生物發光側流免疫層析方法，首先將分析物與重組示蹤物共同競爭硝酸纖維素膜上的捕獲抗體的結合位點，然后洗膜，并加入反應底物產生熒光信號，配合手機檢測配件，使用智能手機對檢測結果進行拍照，最后對手機拍照的圖像進行分析及結果判定。本發明提供的方法利用噬菌體展示多肽模擬表位與可催化發光酶的重組蛋白為示蹤物，配合智能手機，以側流層析的方式實現對小分子化合物的檢測。本發明靈敏度高、快速、簡便、經濟、實用性強，可以實現現場定量檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種氯噻啉生物發光側流免疫層析方法，利用噬菌體展示多肽模擬表位與可催化發光酶的重組蛋白為示蹤物，配合智能手機，以側流層析的方式實現對小分子化合物的在線、定量檢測。

背景技術

氯噻啉是我國自主研發的新煙堿類殺蟲劑，廣泛用于防治小麥、水稻、果樹和蔬菜等作物上的害蟲。然而，過量的使用使其廣泛分布于水體和農產品中，對非靶標生物如蜜蜂等造成了潛在的威脅。因此，建立簡單、快速、靈敏的檢測方法監測環境和農產品中氯噻啉殘留是保障環境和農產品安全的重要抓手。

噬菌體展示隨機多肽庫已廣泛應用于免疫檢測，病原細菌檢測，細胞成像等領域。在小分子免疫分析中，噬菌體展示隨機肽的主要有兩個用途：1)篩選模擬表位代替化學半抗原或分析物，開發競爭型免疫分析；2)篩選抗免疫復合體，其能與抗原-抗體的復合物結合，開發非競爭型免疫分析。噬菌體展示隨機多肽容易獲得且在分析中具有較高的敏感性。然而，由于噬菌體顆粒的尺寸較大(880×6-7nm)，流動性較差，限制了噬菌體展示肽的應用。使得噬菌粒展示多肽技術不適合用于開發快速檢測。另一方面，噬菌體不是一種常規的生產試劑，作為商業試劑使用可能存在不同批次間的差異，長期儲存的穩定性和其生物安全性也進一步限制了其應用。為了克服這些缺陷，通過化學方式合成噬菌體展示的多肽，并與載體蛋白，納米顆粒或者鏈霉親和素偶聯，已經被用于開發無噬菌體的小分子免疫分析，但化學合成代價較高，合成后仍需標記。并不適合大量生產。將多肽與蛋白質融合表達制備重組蛋白，則可通過細菌發酵來實現大量的生產，大大降低成本。而且，如果與多肽融合的蛋白是具有活性的酶，那么這種重組蛋白則又可以直接作為示蹤物，避免了標記步驟。

隨著智能手機攝像功能和數據處理功能的快速發展，使得其可作為一種便攜式檢測設備。而基于發光信號的檢測，不需要外界光源的存在，是一種非常適合應用于便攜式檢測的信號。將智能手機檢測和多肽模擬表位重組示蹤物相結合，開發一種基于多肽模擬表位重組示蹤物和智能手機讀取信號的發光側流免疫層析方法。該發明為食品安全檢測、農產品等的出入境檢測、環境監測部門的監測提供有效的技術手段和檢測方法。對我國農產品的可持續發展和食品安全問題具有重要的現實意義和重要的社會、經濟價值。目前，國內外尚未見有基于模擬表位多肽與可催化發光的酶重組表達示蹤物的生物發光側流免疫層析方法的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新穎、快速、靈敏和經濟的發光側流免疫層析系統，利用多肽模擬表位重組示蹤物(在本說明書中使用納米熒光素酶(NanoLuc)與氯噻啉多肽模擬表位C2-15融合表達)，結合智能手機檢測，以實現對小分子的定量、在線檢測。

本發明提供的一種氯噻啉生物發光側流免疫層析方法，包括：

1.一種氯噻啉生物發光側流免疫層析方法，其特征包括：

第一步：重組示蹤物與分析物共同競爭捕獲抗體的結合位點，

硝酸纖維素(NC)膜的處理：用PBS稀釋的分析物抗體(3.6mg/mL)和抗His-tag抗體(1.5mg/mL) 分別作為檢測(test，T)線和控制(control，C)線，噴在NC膜上，兩條線的間距為5mm，將NC膜在 37℃下干燥1小時，然后與樣品墊(玻璃纖維墊)和吸水墊組裝成整條，將組裝好的膜切成5mm寬，并裝入暗盒中，在室溫下儲存備用；加樣：將50μL的樣品與50μL的重組示蹤物：SEQ ID No.1所示序列 (含有5μg蛋白質，0.2％吐溫20和2mg/mL BSA)混合，并將混合物加入到上樣孔并流過膜15分鐘；