[發(fā)明專利]一種微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810016415.6
• 申請(qǐng)日: 2018-01-08
• 公開（公告）號(hào): CN108103030B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江興華;張小蘭;阮鷺靜;陳麗萍;崔龍萍;朱鴻杰;徐麗云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 兆豐華生物科技（福州）有限公司;兆豐華生物科技（南京）有限公司;北京科牧豐生物制藥有限公司;兆豐華生物科技（南京）有限公司北京生物醫(yī)藥科技中心
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N5/071;C12N5/02;C12R1/93
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本發(fā)明公開了一種微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的方法，包括以下步驟：1）轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞消化，2）細(xì)胞過濾，3）細(xì)胞接毒上罐培養(yǎng)，4）24h換液，5）收獲一收抗原，6）再次消化細(xì)胞上罐，7）收獲二收抗原并換液培養(yǎng)，8）收獲三收抗原，9）將一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分別過濾去除微載體，得到抗原液并進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。本發(fā)明方法能夠提高細(xì)胞貼壁效率，減少細(xì)胞團(tuán)塊，提高細(xì)胞密度，并且能夠提高單批抗原收獲量，提高抗原效價(jià)，降低生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的方法。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒2型的培養(yǎng)方法一般為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)與微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程一般為：使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后用酶消化液消化傳代放大培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行同步接毒，豬圓環(huán)病毒2型種毒按一定的接毒量接入轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至72-96h收獲病毒液。

該方法存在以下不足：由于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞的表面積有限，所以培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞密度低，接毒后培養(yǎng)的病毒效價(jià)也相對(duì)低。

微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程一般為：1.消化轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞上罐：用胰酶消化液消化轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞，并搖勻消化后的細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按規(guī)定細(xì)胞密度把所需細(xì)胞量加入反應(yīng)器罐中，同時(shí)按一定的接毒量接入豬圓環(huán)病毒2型種毒，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器各項(xiàng)培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。2.換液培養(yǎng)及收獲：反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后更換維持液，繼續(xù)培養(yǎng)到所需時(shí)間，然后收獲上清液。

該方法存在以下不足：1、細(xì)胞從轉(zhuǎn)瓶中消化下來細(xì)胞團(tuán)塊較多，細(xì)胞在微載體中貼壁不均勻，而且有很多團(tuán)塊貼附在微載體上，在培養(yǎng)的過程中團(tuán)塊細(xì)胞容易死亡或提前脫落，造成細(xì)胞密度不足，收獲的抗原效價(jià)不高。2、圓環(huán)病毒培養(yǎng)一般為同步接毒，接毒后的細(xì)胞培養(yǎng)至48h后細(xì)胞開始大量脫落，48h后由于細(xì)胞脫落較多，病毒繁殖不足，最終收獲的抗原效價(jià)不高。3、收獲抗原時(shí)只收獲上清，由于在收獲時(shí)，載體上還是有部分帶毒細(xì)胞無法脫落，損失一部分病毒，造成收獲的抗原效價(jià)不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的方法，該方法采用改進(jìn)微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝，能夠提高抗原效價(jià)，提高單批抗原收獲量，降低生產(chǎn)成本。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型的方法，包括以下步驟：

1)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞消化：選擇細(xì)胞狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)瓶PK-15細(xì)胞，使用胰酶消化液消化細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞充分搖勻；

2)細(xì)胞過濾：使用10-20微米的細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞，得到細(xì)胞液，過濾后的細(xì)胞呈大部分單個(gè)，少部分2-3個(gè)的細(xì)胞狀態(tài)，取少量過濾后的細(xì)胞液用維持液進(jìn)行4-6倍稀釋，然后取少量稀釋后細(xì)胞液加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算出過濾后細(xì)胞液的細(xì)胞密度；

3)細(xì)胞接毒上罐培養(yǎng)：將微載體按3-5g/升加入生物反應(yīng)器中，同時(shí)加入7-9倍微載體體積的含血清的營(yíng)養(yǎng)液，將豬圓環(huán)病毒2型毒種按培養(yǎng)體積的1-5％的量加入細(xì)胞液中，然后將細(xì)胞液加入生物反應(yīng)器中，所述細(xì)胞液的加入量根據(jù)細(xì)胞液密度按每個(gè)微載體30-50個(gè)細(xì)胞計(jì)算，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，其中，溫度為

36.5-37.5℃，DO為50-60％，PH為7.2-7.4，攪拌轉(zhuǎn)速為40-60r/min，開啟自動(dòng)通氣系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；