[發明專利]一種微載體生物反應器培養豬圓環病毒2型的方法

有效

• 申請號: 201810016415.6
• 申請日: 2018-01-08
• 公開（公告）號: CN108103030B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 江興華;張小蘭;阮鷺靜;陳麗萍;崔龍萍;朱鴻杰;徐麗云
• 申請（專利權）人: 兆豐華生物科技（福州）有限公司;兆豐華生物科技（南京）有限公司;北京科牧豐生物制藥有限公司;兆豐華生物科技（南京）有限公司北京生物醫藥科技中心
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N5/071;C12N5/02;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種微載體生物反應器培養豬圓環病毒2型的方法，其特征在于：其包括以下步驟：

1）轉瓶細胞消化：將轉瓶PK-15細胞用胰酶消化液消化細胞，將消化后的細胞搖勻；

2）細胞過濾：使用10-20微米的細胞過濾器過濾細胞，得到細胞液，取少量過濾后的細胞液用維持液進行4-6倍稀釋，然后取少量稀釋后細胞液加至細胞計數板進行細胞計數，計算出過濾后細胞液的細胞密度；

3）細胞接毒上罐培養：將微載體按3-5g/升加入生物反應器中，同時加入7-9倍微載體體積的含血清的營養液，將豬圓環病毒2型毒種按培養體積的1-5%的量加入細胞液中，然后將細胞液加入生物反應器中，所述細胞液的加入量根據細胞液密度按每個微載體30-50個細胞計算，調節生物反應器中的細胞培養參數，其中，溫度為36.5-37.5℃，DO為50-60%，PH為7.2-7.4，攪拌轉速為40-60r/min，開啟通氣系統進行細胞培養；

4）24h換液：當生物反應器中細胞培養至24h后，停止加熱和攪拌，關閉通氣系統，靜置3-5分鐘，排出細胞培養液，然后加入等量的含3mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的細胞維持液，開啟通氣系統，繼續在加熱和攪拌條件下培養細胞；

5）收獲一收抗原：當生物反應器中細胞培養至48-52h后，停止加熱和攪拌，關閉通氣系統，靜置3-5分鐘，收獲上清液，為一收抗原，開啟通氣系統，繼續在加熱和攪拌條件下培養細胞，將一收抗原置于-15℃下冷凍保存；

6）再次消化細胞上罐：再次將轉瓶PK-15細胞按照步驟1）和2）進行轉瓶細胞消化和細胞過濾，得到細胞過濾液，然后將細胞過濾液加入生物反應器中培養，所述細胞過濾液的加入量滿足10-20個細胞/個微載體，調節生物反應器中的細胞培養參數，其中，溫度為36.5-37.5℃，DO為50-60%，PH為7.2-7.4，攪拌轉數為40-50r/min，開啟通氣系統進行細胞培養，8-10h后將攪拌轉數調為50-60 r/min；當接毒細胞培養至72h時添加D-氨基葡萄糖鹽酸，使D-氨基葡萄糖鹽酸在細胞維持液中的濃度為3mmol/L；

7）收獲二收抗原并換液培養：當生物反應器中細胞培養至96 h后，停止加熱和攪拌，關閉通氣系統，靜置3-5分鐘，再次收獲上清液，為二收抗原，將二收抗原置于-15℃下冷凍保存，重新加入等量的細胞維持液繼續培養，調節生物反應器中的細胞培養參數，其中，溫度為36.5-37.5℃，DO為50-60%，PH為7.2-7.4，攪拌轉數為50-60r/min，開啟通氣系統，繼續在加熱和攪拌條件下培養細胞；

8）收獲三收抗原：當反應器中細胞培養至120-144h后，調節攪拌轉數為100-150r/min，攪拌3-5分鐘，停止加熱，關閉通氣系統，再次收獲上清液，為三收抗原，將三收抗原置于-15℃下冷凍保存；

9）凍融、過濾收獲抗原液：將一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分別過濾去除微載體，得到抗原液并進行效價檢測。

2.根據權利要求1所述的一種微載體生物反應器培養豬圓環病毒2型的方法，其特征在于：步驟1），所述胰酶消化液中胰酶的質量分數為0.25％。

3.根據權利要求1所述的一種微載體生物反應器培養豬圓環病毒2型的方法，其特征在于：步驟9)，所述過濾采用孔徑80-120微米的過濾網。

4.根據權利要求1所述的一種微載體生物反應器培養豬圓環病毒2型的方法，其特征在于：所述通氣系統模式為Air/O₂/CO₂模式。