[發明專利]一種抗漂白單分子定位三維超分辨顯微系統

有效

• 申請號: 201810014176.0
• 申請日: 2018-01-08
• 公開（公告）號: CN107941777B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 李旸暉;周輝;李雨雪;劉小煜;夏成樑
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州之江專利事務所(普通合伙) 33216
• 代理人: 黃燕

本發明公開了一種抗漂白單分子定位三維超分辨顯微系統，包括第一激光器、擴束準直單元、相位光柵、第三透鏡、第一二色鏡、物鏡、樣品臺、濾光片、第四透鏡、探測器、第二二色鏡、第二激光器。本發明利用時域聚焦特性，只在時域聚焦平面產生樣品的熒光激發，并同時實現對整個時域聚焦平面內熒光的激發。因此，本發明與原有技術相比，能夠避免對非聚焦平面內樣品的漂白，并能夠有效提高SMS熒光顯微技術的工作效率。

技術領域

本發明涉及光學儀器領域、生物醫學顯微成像領域，具體涉及一種抗漂白單分子定位三維超分辨顯微系統及方法。

背景技術

目前在生物醫藥領域的研究對顯微系統分辨率的要求越來越高，研究人員需要了解各種微小形態物質的三維結構，然而傳統白光寬場顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的光斑尺寸無法達到這樣的分辨率，而超分辨顯微系統的出現完美地解決了這個問題。在超分辨顯微技術中，目前的研究熱點大多集中于各類熒光顯微技術方面，諸如受激發射損耗(STED)熒光顯微技術和單分子定位熒光顯微技術(SMS)等。與STED熒光顯微技術相比，SMS熒光顯微技術的光路設計、機械結構都較為簡單，無需多光束的合束，因此實際使用較廣泛。SMS熒光顯微技術的基本原理是用PA-GFP來標記蛋白質，通過調節405nm激光器的能量，低能量照射細胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子，然后用488nm激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子。在確定這些分子的位置后，再長時間使用488nm激光照射來漂白這些已經定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來。之后，分別用405nm和488nm激光來激活和漂白其他的熒光分子，進入下一次循環。這個循環持續上萬次后，我們將得到細胞內所有熒光分子的精確定位。

E.Betzig等人在期刊Science第313期的文章Imaging IntracellularFluorescent Proteins at Nanometer Resolution中提到采用寬場照明和連續激光作為光源簡化SMS熒光顯微系統的結構。但是，如果要對樣品實現大深度的三維成像(成像范圍在深度方向上大于1μm)時，需要結合微位移臺改變樣品的高度來實現。在這種工作模式下，由于在整個成像過程中，整個樣品，包括處在非觀測平面的區域內的熒光蛋白都會被激發。非觀測平面熒光蛋白被長期激發，會導致熒光蛋白失去活性，被漂白。當微位移平臺繼續移動，使原來的非觀測觀測區域成為成像平面后，由于之前熒光蛋白已經被漂白，該成像平面將無法實現熒光蛋白再激發、成像的過程。該問題在利用SMS熒光顯微技術進行深層組織成像時尤為明顯。因此，現有的三維SMS并不能很好的滿足實際的需求。

發明內容

本發明針對之前三維SMS熒光顯微技術在進行深度方向掃描時，存在的熒光蛋白分子被漂白等問題，提出了一種新型的抗漂白單分子定位三維超分辨顯微系統。該系統利用時域聚焦特性，不漂白非聚焦平面的熒光蛋白分子，結構簡單，并且通用性好、也可用于二維成像。

一種抗漂白單分子定位三維超分辨顯微系統，包括第一激光器、擴束準直單元、相位光柵、第三透鏡、第一二色鏡、物鏡、可正對物鏡往復移動的樣品臺、濾光片、第四透鏡、探測器、第二二色鏡、第二激光器；

所述第一激光器出射的激光經過擴束準直單元擴束準直后，傾斜入射到相位光柵表面，并被相位光柵反射后照射至第二二色鏡；

所述第二激光器出射的激光被第二二色鏡反射后，與來自第一激光器并經第二二色鏡透射的激光合束，經過第三透鏡、第一二色鏡后被聚焦在物鏡的后焦平面處，寬場照明樣品臺上的整個樣品，激活樣品內部分的熒光標記；

所述第一激光器出射的激光從物鏡出射后將在物鏡的焦平面處產生時域聚焦，激發樣品臺上處于時域聚焦平面的已被第二激光器激活的樣品的熒光；

所述樣品臺移動時，物鏡出射的激光的時域聚焦平面處于樣品的不同深度，激發樣品不同深度處的熒光，實現對樣品中被激活的熒光標記的逐層掃描；