[發明專利]A群牛輪狀病毒檢測試劑盒和該病毒抗體膠體金試劑制備方法

在審

• 申請號: 201810013771.2
• 申請日: 2018-01-08
• 公開（公告）號: CN108152501A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 胡士林;崔曉辰;鄭建楠;李明群;曹雷;馬愛霞;崔尚金
• 申請（專利權）人: 山東畜牧獸醫職業學院;濰坊科瑞斯生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

本發明涉及一種A群牛輪狀病毒檢測試劑盒，包含試劑R1和試劑R2。本發明還涉及一種A群牛輪狀病毒檢測試劑盒的制備方法，包括燒制膠體金；將抗體與膠體金納米顆粒偶聯，得到偶聯抗體的納米金顆粒溶液；離心，沉淀用含穩定劑、防腐劑的緩沖液重懸，調整濃度。本發明具有較高的檢測靈敏度和特異性，穩定性好，操作簡單，反應時間短；適用于全自動生化分析儀、特種蛋白儀及分光光度計，反應后不產生沉淀，便于反應杯清洗；本發明試劑盒與IPMA、ELISA、免疫熒光、免疫層析等方法對樣本中BRoV檢測數據統計分析，檢測結果可靠，較膠乳法生產成本更低，具有較大的市場競爭力。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說是一種A群牛輪狀病毒檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

輪狀病毒是各種幼齡動物和嬰幼兒病毒性腹瀉的病原之一。1968年Mebus等人在美國阿拉斯加州一農場犢牛腹瀉糞便中首次發現牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRoV），以后在歐洲、美洲、澳大利亞、新西蘭、日本等都發現了由牛輪狀病毒引起的犢牛腹瀉。

BRoV屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的雙鏈RNA病毒，BRoV感染時引起犢牛爆發腸道機能紊亂的一種急性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為主要特征，給養牛業帶來嚴重的危害。BRoV病毒粒子略呈圓形，具有雙層衣殼，直徑65-75nm。中央是一個電子致密六角形核心，為RV的芯髓，直徑37-40nm；芯髓周圍繞有一個電子透明層，殼粒由此向外呈輻射狀排列，構成內衣殼；外周是一層由光滑薄膜構成的外衣殼，厚約20nm，是在內質網膜上芽生時獲得的。以核心為轂，以呈輻射狀排列的內衣殼為輪輻，以外衣殼為輞，構成特征性的輪狀結構。電子顯微鏡水平下可以對輪狀病毒與呼腸孤病毒加以區分。電子顯微鏡觀察發現，輪狀病毒的內衣殼殼粒為棍棒狀，向外呈輻射狀排列，外周為一層由光滑薄膜構成的外衣殼，故而病毒粒子表面光滑；相反，呼腸孤病毒內衣殼的殼粒接近球形或呈短棱柱狀，外衣殼的殼粒清楚可見，故整個病毒的表面呈粗糙顆粒狀。此外，輪狀病毒的核心小于呼腸孤病毒的核心。

BRoV存在多種血清型，我國牛群中輪狀病毒感染以A群為主，在A群BRoV中VP6蛋白是群抗原，在各毒株中高度保守。我國BRoV的診斷主要依賴于實驗室的常規診斷，這些常規的診斷技術有其優點，但也有其固有的缺點。成本高、需要特殊的昂貴的儀器、需要特殊技術人員、存在有害物質等因素影響了對BRoV的及時診斷，尤其是對BRoV的現地診斷，從而也影響了對BRoV的及時預防和治療。

隨著單克隆抗體技術的發展和全自動生化分析儀、蛋白分析儀的普及，免疫比濁技術已經發展出多種快速免疫比濁檢測技術，已被廣泛應用于臨床診斷、生物材料分析的等技術實踐中。

納米顆粒增強比濁法（Particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA）是一種較為穩定、準確的均相免疫比濁檢測方法。

PETIA法大體分為兩種：一種是散射比濁檢測法，另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理非常相似，都是在高分子納米微球的表面交聯單克隆抗體，當交聯有抗體的微球與抗原結合后，在短時間內會迅速聚集在一起，改變了反應液的散光性能或透光性能。而且，反應液散光性能或透光性能（即吸光度）的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性,在一定范圍內可以反映被測抗原的濃度。

PETIA檢測方法是在均相反應體系中進行抗原、抗體反應及結果的測定。抗原、抗體反應后，直接測定反應液的吸光度值，省卻了ELISA法反復孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結果，省時省力。

此外，PETIA操作步驟的簡化也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環境等外界因素的干擾，穩定性和重復性都較好，能較真實地反映被測物質的存在情況。納米級粒子的推出解決了對單克隆抗體結合的能力不強，臨床檢測的線性范圍窄，干擾因素多，實驗穩定性差等問題，大大促進了免疫比濁法在臨床上的廣泛應用。

發明內容