[發明專利]豬圓環病毒3型全基因組擴增方法及其PCR引物

在審

• 申請號: 201810006490.4
• 申請日: 2018-02-22
• 公開（公告）號: CN110184282A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 付朋飛;張學賢;馬良;趙亞榮
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司動物醫學研究中心;福州大北農生物技術有限公司;北京科牧豐生物制藥有限公司;北京大北農科技集團股份有限公司
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/11;C12Q1/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了豬圓環病毒3型全基因組擴增方法及其PCR引物。發明所述的豬圓環病毒3型全基因組序列如Seq ID No.1所示。擴增本發明所公布的豬圓環病毒3型全基因組序列所用引物包括P1 5?ACCCAGGACAAAGCCTCTTC?3、P2 5?GGGTGAGCGCTGGTAGTTCC?3、P3 5?ATAAGATACTAAAGATGAAAGTTACAC?3和P4 5?TTAGAGAACGGACTTGTAACG?3。本發明所提供的引物P1/P2可直接擴增出豬圓環病毒3型全基因組序列，引物P3/P4擴增出的目的片段序列對引物P1和P2作用位置序列進行補充和修正即可。本發明所述豬圓環病毒3型全基因組序列及特異性檢測引物為該病毒的流行病學調查，遺傳進化分析等提供了有效的支持。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及豬圓環病毒3型全基因組測序引物及方法。

背景技術

豬圓環病毒(porcine circovirus，PCV)是圓環病毒科圓環病毒屬的重要成員。是現在已知的最小的單股環狀DNA病毒，該病毒無囊膜對環境抵抗力較強。已分離到毒株并明確分型的有兩個基因型：無致病性的1型(PCV1)和具有致病性的2型(PCV2)，PCV2主要損害豬體免疫系統，導致免疫抑制，給世界養豬業造成了巨大損失，與PCV2相關的疾病有仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙、呼吸系統疾病和腸道疾病等。

2015年6月，美國北卡羅來納州一個商品化豬場暴發了皮炎腎病綜合征(PDNS)，母豬死亡率同比往年平均水平增加了10.2％，受孕率下降了0.6％，窩均木乃伊胎同比往年平均水平增加了1.19％。死亡母豬表現出典型PDNS。但所有母豬組織樣品，包括腎臟，淋巴結，肺臟和皮膚組織樣品，通過免疫組化(IHC)和實時熒光定量PCR(qPCR)檢測未發現PCV2，PRRSV和IAV；此外，用qPCR檢測胎兒組織，均均呈PCV2，PRRSV和PPV陰性。后用宏基因組測序在發病豬病料中發現了一種新型圓環病毒，命名為PCV3。PCV3基因組包含2000個堿基，具有與PCV1和PCV2類似的基因組結構，主要編碼cap和rep兩個蛋白。之后我國研究學者通過PCR檢查方法發現，PCV3在我國豬群中也存在著廣泛分布，截止目前世界范圍內尚未有分離到毒株的報道，PCR檢查是目前主要的檢測手段。

CN106929607A公開了一種檢測豬圓環病毒3型病毒的引物對、方法及試劑盒，具體公開了：根據參考比對GenBank中所有PCV3Rep基因序列，選擇特定核苷酸序列作為擴增區域，設計了一對用于檢測豬圓環病毒3型的SYBR Green I熒光定量RT-PCR引物，建立了特異、靈敏、穩定、可靠的PCV3SYBR GreenRT-qPCR檢測系統，操作簡單可靠，有利于疾病的及時診斷治療。

徐朋麗等，2017，中國預防獸醫學報，公開了豬圓環病毒3型PCR檢測方法的建立及應用，具體公開了：為建立一種用于檢測豬圓環病毒3型(PCV3)的PCR方法，針對GenBank中PCV3全基因序列在其保守區設計一對特異性引物，并優化反應條件，建立了PCV3的PCR檢測方法。結果顯示，該PCR方法僅對PCV3檢測為陽性，而對其它常見病原的DNA模板均無擴增。對PCV 3的最低檢出量為61.9拷貝/μL。結果表明該方法具有良好的特異性和敏感性。通過該方法對133份臨床樣品進行檢測，結果顯示PCV3陽性率為29％(38/133)，表明PCV3在河南地區已有流行。該方法的建立使PCV3的檢測更為快速、簡便、經濟、實用，為PCV3感染的早期診斷提供了有力的技術支持。

Ku et al.,2017,Transbound Emerg Dis,公開了中國PCV3的鑒定和遺傳表征，具體公開了，用兩對引物擴增出了PCV3的全基因組。