[發(fā)明專利]一種檢測CAR-T細胞數(shù)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810001908.2
• 申請日: 2018-01-02
• 公開（公告）號: CN108107204B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賴沛龍;陳曉梅;翁建宇;杜欣
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;G01N33/566
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 劉菁菁

本發(fā)明提供了一種檢測CAR?T細胞數(shù)的方法，其是在CAR?T細胞中引入C5aR，檢測C5aR的表達率從而獲得CAR?T細胞數(shù)。本發(fā)明首次通過實驗證實C5aR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可用于CAR?T細胞數(shù)檢測，而且還發(fā)現(xiàn)引入C5aR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不僅不影響CAR?T細胞殺傷功能、反而具有增強CAR?T細胞殺傷功能作用，因此引入C5aR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域作為檢測CAR?T細胞數(shù)的方法具有很廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤的細胞免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及嵌合抗原受體T細胞數(shù)檢測技術(shù)，尤其汲及一種新的檢測嵌合抗原受體T細胞數(shù)的方法。

背景技術(shù)

嵌合抗原受體(CAR,Chimeric Antigen Receptors)T細胞是有望治愈腫瘤的里程碑事件,CAR-T技術(shù)是應(yīng)用基因改造技術(shù)，將一段識別腫瘤抗原的單鏈抗體(single chainfragment variable,scFv)和胞內(nèi)活化基序重組基因轉(zhuǎn)染至T淋巴細胞上以達到更好的識別及殺傷腫瘤的作用。CAR-T分子通常包括胞外絞鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)。其中胞外絞鏈區(qū)是由單鏈抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過一條肽段連接而形成；跨膜區(qū)則主要來自于如CD8、CD28或4-1BB等分子的跨膜區(qū)；胞內(nèi)信號區(qū)則主要來自于CD28、4-1BB、CD3zeta、CD27或OX-40等T細胞傳導(dǎo)信號分子的胞內(nèi)段嵌合體。高親合力，高特異性的scFv決定CAR-T靶向某種抗原，一旦結(jié)合抗原，CAR的胞內(nèi)段會傳輸活化以及共刺激信號給T細胞，激活T細胞進而有效靶向殺傷腫瘤細胞。T細胞的激活需要兩種活化信號，即T細胞表面的TCR-CD3與MHC-I分子結(jié)合為活化的第一信號,決定T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性；T細胞表面的共刺激分子與相應(yīng)配體結(jié)合為活化的第二信號,決定T細胞增殖。簡而言之,CAR-T細胞通過抗原-抗體識別模式對腫瘤細胞表面的特異分子進行識別,然后通過其胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)進行激活、增殖并發(fā)揮細胞殺傷功能。

CAR-T技術(shù)已經(jīng)解決了T細胞的靶向性、殺傷性和體內(nèi)增殖等難題。但目前如何準確確定體內(nèi)CAR-T細胞的數(shù)量，不影響CAR-T功能，獲知CAR-T細胞在體內(nèi)的變化情況，提前預(yù)防因CAR-T引起的細胞因子風(fēng)暴等，進而對患者的臨床細胞治療方案提供依據(jù)，成為目前亟需要解決的技術(shù)問題。目前對于CAR-T細胞數(shù)的檢測主要是：1、使用PCR方法檢測胞外scFV，缺點是檢測方法耗時長、相對定量，不同的scFV需要設(shè)計不同的PCR引物和探討；2、CAR分子中引入綠色熒光蛋白(GFP)，這是目前檢測CAR-T比較精確的方法，但因GFP是在水母中發(fā)現(xiàn)，并不存在于人體，其安全性需要長時間觀察，而且因人體內(nèi)不存在GFP可能會產(chǎn)生抗GFP的抗體，進而影響CAR-T細胞功能；3、在胞外區(qū)域的鉸鏈區(qū)引入IGG4或IGG1等，通過流式檢測IGG4或IGG1的表達量，其缺點是引入IGG4或IGG1后，使CAR-T分子量增加，影響CAR-T轉(zhuǎn)染率，而且人體內(nèi)本身也存在IGG4或IGG1，檢測結(jié)果并不完全精確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出了一種檢測CAR-T細胞數(shù)的方法，操作方便，測量結(jié)果精確，可通過實時樣品的檢測獲知CAR-T細胞在體內(nèi)的變化情況，從而為有效的指導(dǎo)細胞治療進一步安全的實施提供依據(jù)。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：在CAR-T細胞中引入C5aR，檢測C5aR的表達率從而獲得CAR-T細胞數(shù)。

在具體的實施方案中，C5aR除可以表達于CAR-T細胞胞內(nèi)，還可以表達于其表面，進一步優(yōu)選地，所述C5aR為CAR-T胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在CAR-T分子胞內(nèi)引入C5aR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，并檢測C5aR的表達率。

具體地來說，本發(fā)明是構(gòu)建一種嵌合抗原受體，其包含能夠結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和至少一個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所述至少一個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是指C5aR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，或與C5aR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)的信號傳遞區(qū)域的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。“胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域”是指已知在細胞中作為傳輸信號以引起生物過程的活化或抑制的結(jié)構(gòu)域起作用的任何寡肽或多肽。