[發明專利]引物末端酶解二聚體法PCR

有效

• 申請號: 201810001086.8
• 申請日: 2018-01-02
• 公開（公告）號: CN108085372B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 江洪;江雨康
• 申請（專利權）人: 江洪
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 北京百歐知識產權代理事務所(普通合伙) 11930
• 代理人: 吳泳歷

引物末端酶解二聚體法PCR，其特征是采用3'最末端第1/2個堿基均為A/a腺嘌呤結尾的引物和底物dUTP/dU代替dTTP滲入PCR產物酶解污染策略；尿嘧啶?DNA糖基化酶UDG酶解引物二聚體的缺/脫dU產物仍是引物結合模板，引物對3'最末a配對PD產物鏈脫dU處既缺堿基可匹配結合又無模板可復制；無a結尾引物須變一個3'末端RNA(rN)堿基以增加RNase酶解PD污染；使用eUDG、及RNaseH?II和內切酶III?VIII、限制內切酶消化前次或歷次PCR產物氣霧膠、靶交叉污染，聯用中部同序引物減少內源PD產生，PCR成分加蔗糖分層緩釋并礦物油封閉，熱啟動、熱滅活不耐熱酶。

技術領域：

本發明屬于分子生物學及分子檢驗的核酸擴增PCR技術領域，具體涉及堿基修飾引物末端的酶解來限制或去除其引物二聚體PD產物非特異性污染的PCR領域。

背景技術：

多聚酶鏈反應PCR背景可追溯至其歷史發展源頭，1953年Watson建立DNA雙螺旋模型及半保留復制法則為PCR擴增奠定了其分子基礎，甚至1971年Khorana就已發表了一核酸體外擴增(J.Molec.Biol.,56:341)相關論文；但限于當時技術條件不足,沒有產生成熟的核酸擴增技術。直到1985年美國Cetus公司Mullis根據一端引物測序原理,想到了一對引物結合延伸-指數擴增或幾何級數式放大的巨大威力,才發明了一對特異引物結合、復制靶分子基因,體外(于試管內)模擬天然基因半保留復制的PCR技術；再經過一系列發展和耐熱聚合酶、熱循環儀的發明、應用，Cetus公司于1987年申請了首個PCR發明專利(US Patent 4,683,202)。擴增過程一般經靶DNA變性：加溫94℃使雙鏈解離成為單鏈；引物退火(復性)：降溫至54℃左右使過量引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物延伸：升溫至72℃左右，DNA單鏈模板—引物結合物在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，尊循堿基反向配對與半保留復制原理，引物末端按5'-3'方向延伸、合成一條新的與模板DNA鏈反向互補的半保留復制鏈，不斷重復循環變性--退火--延伸三過程，這種新鏈又可成為下次循環的模板，靶分子以2ⁿ級數產生更多的“半保留復制”新鏈。

超級靈敏度的指數放大或幾何級數放大是PCR最核心的本質或優點，靶分子以2ⁿ級數放大,常規30個熱循環反應2³⁰約等于10⁹放大倍數,擴增放大倍數似原子裂變鏈式反應難以想象,也是一般線性放大檢測方法無可比擬的,靈敏度遠遠大于普通檢測方法的放大倍數,近40個循環反應放大10¹²倍或達飛克fg/ml即個位數分子水平檢測。這也是PCR成為應用最廣的最核心技術甚至多少個最形容也絕不過分的根本原因。同樣，指數放大亦帶來PCR高度特異性和頑固的非特異性，PCR特異性直接來源于引物序列的特異性,一端引物序列一點非特異錯配擴增甚至僅一側完全配對擴增也僅是線性放大,自然遠遠趕不上指數擴增或幾何級數放大，引物特異性任何一點降低或與靶一丁點不匹配也就擴增速率落下了,而遠遠趕不上特異的指數或幾何級數放大；反過來說,只要是靶分子以指數擴增或幾何級數放大，PCR擴增檢測就具有足夠高特異性。非特異性同理，各種常規檢驗方法遇見的非特異性原因雖也存在于PCR技術,但終究趕不上指數擴增放大，僅一條引物非特異結合線性擴增遠遠趕不上指數非特異性,只有一對引物均非特異結合、延伸的擴增才是唯一指數非特異性原因,引物間非特異聚合并互為模板、互為引物的二聚體PrimerDimer(PD)指數擴增是PCR非特異性本質,也是其難以克服的根本原因,一般3'末端數個堿基連續反向互補的引物對于不加模板的本底PCR擴增反應中約幾個—十幾個循環處即出現引物二聚體PD擴增；一對常規設計的引物對于本底PCR反應30個循環開始出現顯著的PD非特異性擴增，并遮蓋和抑制位于30-38循環的數千拷貝數以下的低濃度靶分子擴增檢測，這也是普通PCR只進行30個循環反應的主要原因。