[發明專利]引物末端酶解二聚體法PCR

有效

• 申請號: 201810001086.8
• 申請日: 2018-01-02
• 公開（公告）號: CN108085372B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 江洪;江雨康
• 申請（專利權）人: 江洪
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 北京百歐知識產權代理事務所(普通合伙) 11930
• 代理人: 吳泳歷

1.引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征是采用引物末端堿基修飾并且在PCR反應試劑混合之前進行修飾產物酶解去除污染引物二聚體的PCR技術，具體為以下三種方法中的任意一種：

(1)選取3'最末端倒數第1/2個堿基或1-2個堿基均為A/a腺嘌呤結尾設計的一對引物，底物dUTP/dU代替dTTP滲入PCR產物包括引物二聚體產物，通過PCR試劑成分預先加入體積百分比0.2-2％的濃度為5U/μl的UDG酶，各成分于混合前室溫兩小時至兩天或37℃二十分鐘至兩小時消化前次或歷次PCR產物氣霧膠交叉污染，然后依次混合所述PCR試劑并加入待測純化樣本，立即PCR反應；

(2)無a結尾但離3’末尾小于7-8堿基或一端無a結尾則一對引物均在a之外變一個3'末端rN堿基,或一側a結尾引物變一個3'末端rN堿基而無a結尾引物近3'末端變一個rN堿基，隨機dU代替dT滲入PCR產物，其PCR成分預先加入體積百分比0.2-2％的UDG酶，體積百分比0.2-2％的濃度為5U/μl的RNaseH/HII和體積百分比0.2-5‰的濃度為10U/μl的內切酶EndIII-VIII三酶,成分混合前室溫三小時至三天或37℃半小時至三小時，徹底酶解切斷引物二聚體產物污染，然后依次混合所述PCR試劑并加入待測純化樣本，盡快PCR反應；

(3)3’最末1-2個a結尾一對引物a之外再3'端離3’最末小于6-10堿基處在嘧啶后面變一個rN堿基，底物dU代替dT滲入PCR產物，PCR成分預先加入體積百分比0.5-1％的UDG酶單獨酶解；或PCR成分預先加入體積百分比1％的UDG酶和0.5％濃度為5U/μl的RNaseH/HII先行酶解37℃1-3小時，Taq酶中另加體積百分比0.5-1％的濃度為10U/μl的內切酶EndIII-VIII于PCR反應液混合后37℃不超過30分鐘，程序預設三酶順次水解，然后加樣、啟動PCR反應。

2.根據權利要求1所述的引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物中的一條的引物中部至5'端增加變一個rN堿基、dI堿基或烷基修飾嘌呤；對應地，所有PCR試劑成分在混合前添加UDG酶,RNaseHII酶和hAAG酶，于物理隔絕情況下PCR以杜絕引物二聚體非特異性擴增。

3.根據權利要求1所述的引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征在于：為防止靶分子氣霧膠造成微量污染試劑，PCR試劑成分/各組分混合前還加入不影響靶擴增的稀濃度0.2％-0.5％(v/v)靶序列限制內切酶2-4種混合酶液，利用PCR成分混合前室溫兩小時至兩天或37℃二十分鐘至兩小時酶切消化靶模板分子交叉污染。

4.根據權利要求1所述的引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征在于：PCR用水使用便宜的化學法替代酶法消化污染，新鮮純化水采用加0.1‰-0.2‰(v/v)稀釋的10％次氯酸鈉液室溫1-2天消化污染DNA，再開蓋煮沸除去次氯酸鈉后加0.05‰-0.1‰(v/v)外切酶ExoIII，冷藏待用。

5.根據權利要求1所述的引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物具有中部6-8b同序/相同堿基序列的引物，用于減少引物二聚體程度/推后引物二聚體本底擴增Ct值，部分減少內源性引物二聚體擴增。

6.根據權利要求1所述的引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物中部6-8b同序并且添加一引物中部互補的反義堿基5-9b中部干擾Oligo寡核苷酸抑制劑，選擇性抑制PCR反應內的內源性持續引物二聚體擴增以及消除引物二聚體本底Ct值。

7.根據權利要求1所述的引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征在于：在礦物油密閉PCR反應的情況下，采用含10％蔗糖的引物，結合熱啟動PCR以減少氣霧膠的產生。

8.根據權利要求1所述的引物末端酶解二聚體法PCR方法，其特征在于：PCR反應液添加含甜菜堿和聚陰離子多聚磷酸PCR增效劑，雙向增強靶擴增效率和抑制引物二聚體非特異性擴增。