[發(fā)明專利]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)直接在原始樣品中檢測目標(biāo)DNA并通過高分辨熔解分析進行基因分型的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201780093965.1
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN110945142A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魯?shù)稀ひ敛ǖ侠镏Z;布魯納·馬里尼;愛麗絲·阿維安;馬爾科·莫塞尼戈;尼古拉·福斯基;伊麗莎白·莫羅
• 申請（專利權(quán)）人: 烏利賽生物醫(yī)學(xué)股份公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6851
• 代理公司: 廣州文冠倪律知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44348
• 代理人: 何錦標(biāo);楊婭莉

本發(fā)明公開了一種通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）直接在原始樣品中檢測目標(biāo)DNA并通過高分辨率熔解（HRM）分析進行基因分型的方法。該方法包含稀釋原始樣品、通過先升高后降低的溫度梯度處理稀釋的原始樣品、進行PCR擴增、然后進行HRM分析。該方法還包含監(jiān)測在HRM分析過程中由于釋放嵌入分子或化合物的釋放，溫度誘導(dǎo)的雙鏈擴增子變性為兩個單鏈DNA而產(chǎn)生的信號發(fā)射變化。通過讀取器分析信號變化，通過連接至讀取器的圖形界面獲得分析結(jié)果，從而對原始樣品中的目標(biāo)DNA進行檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開的實施方式涉及通過PCR直接在原始樣品中檢測目標(biāo)DNA并通過HRM分析進行基因分型的方法。特別地，本公開的實施方式描述了用于檢測導(dǎo)致性傳播疾病的幾種病原體（例如但不限于HR-HPV（高風(fēng)險人乳頭瘤病毒））的方法。

更詳細(xì)地，本公開允許在一個多重測定中，直接從原始生物樣品（包括例如陰道或?qū)m頸粘液）中檢測病原體DNA，而無需DNA提取步驟。

背景技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于全世界診斷應(yīng)用的可靠技術(shù)。PCR由在體外擴增特異性的核酸的引物延伸反應(yīng)組成。該反應(yīng)利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，并且其是基于包括不同溫度步驟在內(nèi)的幾個循環(huán)，可以進行DNA變性、引物退火和聚合酶介導(dǎo)的目標(biāo)DNA的延伸。

PCR可以與能夠嵌入雙鏈DNA的熒光染料或熒光標(biāo)記的DNA探針結(jié)合使用；用這種方法，新合成的擴增子產(chǎn)生的信號可以通過熒光采集被實時采集定量。

高分辨率熔解（HRM）是另外的PCR之后的分析步驟，其通過研究雙鏈DNA的熱變性進一步表征擴增子。這是通過分析升溫范圍通常在65℃至95℃內(nèi)、熒光采集速率為0.1 ℃/sec或更小的擴增子解離（熔解）行為來實現(xiàn)的。

HRM已被用于診斷（例如能夠在多態(tài)的等位基因中識別SNP的基因檢測），并且其已被提議用于包括病原體檢測在內(nèi)的多種應(yīng)用。

如今，HRM分析需要高純度的提取的DNA：這將其應(yīng)用主要限制在能夠自動提取DNA的高輸入量（high-income）環(huán)境中。特別地，HRM需要高純度的提取的DNA，因為DNA制備污染會導(dǎo)致熔解曲線發(fā)生不可預(yù)測的失真。

此外，為了獲得高特異性，HRM在需要目標(biāo)專用引物和探針組的PCR反應(yīng)中進行，而這些引物和探針組通常不是十分便宜的試劑。盡管如此，HRM對于低輸入量（low-income）環(huán)境中的有益應(yīng)用（如人類病原體的表征）仍具有巨大的未開發(fā)潛力。

事實上，確實需要提供能夠被用于將HRM技術(shù)直接應(yīng)用于原始樣品中的方法，該方法不需要昂貴且費時的DNA提取步驟，并且無需使用昂貴的引物和探針對。

眾所周知，HPV是全世界浸潤性宮頸癌的必要原因。

該腫瘤是女性中最常見的腫瘤之一，全球超過500,000例¹，并且其主要由高風(fēng)險HPV（HR-HPV）基因型的持續(xù)感染決定；迄今為止，已發(fā)現(xiàn)大約有20種癌癥相關(guān)HR-HPV，其中HPV16和HPV18最為常見（占所有浸潤性宮頸癌的70%）^2,3。有效的宮頸癌篩查項目降低了這種腫瘤的發(fā)病率和死亡率⁴；最初的篩查是通過Papanicolau試驗（Pap試驗）進行的，這是一種能夠識別癌前細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)試驗，通過宮頸內(nèi)刷收集宮頸標(biāo)本后在顯微鏡載玻片上接種和染色后實現(xiàn)。

該技術(shù)具有很高的陽性預(yù)測值，但平均靈敏度差⁵，且陰性預(yù)測值低。

此外，使用宮頸內(nèi)刷可能會帶來痛苦和侵害，并且在心理上會限制部分群體進行檢查，尤其是在出于社會和宗教原因而很少去婦科就診的情況下。