[發明專利]通過聚合酶鏈式反應直接在原始樣品中檢測目標DNA并通過高分辨熔解分析進行基因分型的方法

在審

• 申請號: 201780093965.1
• 申請日: 2017-06-20
• 公開（公告）號: CN110945142A
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 魯迪·伊波迪里諾;布魯納·馬里尼;愛麗絲·阿維安;馬爾科·莫塞尼戈;尼古拉·福斯基;伊麗莎白·莫羅
• 申請（專利權）人: 烏利賽生物醫學股份公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6851
• 代理公司: 廣州文冠倪律知識產權代理事務所(普通合伙) 44348
• 代理人: 何錦標;楊婭莉

1.一種通過聚合酶鏈式反應（PCR）直接在原始樣品中檢測目標DNA并通過高分辨率熔解（HRM）分析進行基因分型的方法，所述方法包含：

-提供要進行檢測分析的原始樣品；

-使用包含蛋白質消化酶的處理緩沖液稀釋所述原始樣品，其中將所述原始樣品稀釋至蛋白質濃度為0.1 μg/μl至10 μg/μl；

-通過先升高后降低的溫度梯度來處理稀釋的原始樣品；

-提供一種PCR反應混合物，該PCR反應混合物包含用于以多重方式擴增兩種或更多種目標核酸的兩對或更多對擴增引物和一種擴增緩沖液，所述擴增緩沖液包含并入雙鏈擴增子中并發射可檢測信號的嵌入分子或化合物；

-使用所述PCR反應混合物和所述經處理的稀釋的原始樣品進行PCR擴增；

-在PCR擴增結束時，對PCR反應混合物和先前進行PCR擴增的所述經處理的稀釋的原始樣品進行HRM分析；

其中所述方法進一步包含在HRM分析過程中監測由于嵌入分子或化合物的釋放，溫度誘導的雙鏈擴增子變性為兩個單鏈DNA而產生的信號發射變化，

其中所述方法進一步包含通過讀取器分析信號變化并通過連接至所述讀取器的圖形界面獲得分析結果來檢測原始樣品中的目標DNA。

2.根據權利要求1所述的方法，其中通過先升高后降低的溫度梯度來處理稀釋的原始樣品，包含進行以下溫度步驟：

-第一孵育步驟，在25 ℃至70 ℃的溫度范圍內進行5至60分鐘，

-第二孵育步驟，在90 ℃至100 ℃的溫度范圍內進行5至60分鐘，

-第三孵育步驟，在0 ℃至10 ℃的溫度范圍內進行5至60分鐘。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白質消化酶選自：內切蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和內肽酶。

4.根據權利要求3所述的方法，其中所述蛋白質消化酶是蛋白酶K，并且所述蛋白質消化酶在所述處理緩沖液中的濃度為1 mg/mL至1 μg/mL。

5.根據權利要求1至4中的任一項所述的方法，其中所述處理緩沖液包含TrisHCl緩沖溶液。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述TrisHCl緩沖溶液的濃度為1 M至10 mM，并且pH為7.0至10.0。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述處理緩沖液進一步包含水解酶。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述處理緩沖液進一步包含pH穩定劑。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述處理緩沖液進一步包含防腐劑。

10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中PCR反應混合物的擴增緩沖液進一步包含選自以下添加劑中的一種、多種或所有添加劑：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化銨）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜堿、大腸桿菌ssDNA結合蛋白、甘油、左旋肉堿和明膠。

11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中提供了用于進行PCR反應的容器（15），所述原始樣品被包含在所述容器（15）中，其中所述容器（15）的第一區域含有包含所述PCR混合物或擴增緩沖液的第一相（14），所述第一相（14）是固體、半固體或凝膠，其中在所述第一區域上或上方具有所述容器（15）的第二區域，該第二區域含有包含所述處理緩沖液的第二相或上相（16），所述第二相或上相（16）是液體，其中使用所述處理緩沖液稀釋所述原始樣品以及通過進行溫度梯度處理稀釋的原始樣品都發生在第二區域中，并且PCR反應及然后進行的HRM分析在同一所述容器（15）中的第一區域中進行。

12.根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中PCR擴增是實時PCR。