[發(fā)明專利]一種用于校正擴增子測序中擴增偏差的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780090677.0
• 申請日: 2017-03-27
• 公開（公告）號: CN110741094B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳鏑;張海川
• 申請（專利權(quán)）人: 賽雷納（中國）醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G16B25/20
• 代理公司: 成都欣圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51292
• 代理人: 王海文;王淇

本發(fā)明公開了一種校正擴增子測序中擴增偏差的方法，通過擴增靶核酸，獲取靶核酸的擴增子覆蓋度，計算每個測試基因組區(qū)域靶核酸和參考基因組區(qū)域靶核酸之間的擴增子覆蓋度比值，去除異常值，應(yīng)用公式對擴增子覆蓋度比值進行歸一化，計算測試基因組區(qū)域擴增子和參考基因組區(qū)域擴增子之間各項參數(shù)的差值和應(yīng)用另一公式擬合數(shù)據(jù)等步驟，將通過擬合計算得出的回歸參數(shù)值用于校正擴增偏差，得到去除擴增偏差后的歸一化擴增子覆蓋度比值，從而消除了多重PCR擴增過程中因?qū)嶒炓蛩匾鸬臄U增偏差。擴增偏差的消除有利于目標基因組區(qū)域拷貝數(shù)的精確計算，從而使應(yīng)用擴增子測序數(shù)據(jù)檢測微小拷貝數(shù)的變異成為可能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是用于校正擴增子測序中擴增偏差的計算方法。

背景技術(shù)

下一代測序或大規(guī)模平行測序通常使用的是多重聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的文庫。3′端穩(wěn)定性、引物解鏈溫度(Tm)、擴增子長度、擴增子GC含量和擴增子側(cè)翼區(qū)GC含量的差異都可能會導(dǎo)致擴增偏差。這種偏差干擾了對目標基因組區(qū)域拷貝數(shù)的精確計算，并阻礙了擴增子測序在檢測微小拷貝數(shù)變異中的應(yīng)用。

通過細致優(yōu)化引物設(shè)計、退火溫度、緩沖液組成和PCR循環(huán)次數(shù)等因素，可以最大限度地減少偏差。見Markoulatos等(2002年)的《臨床實驗室分析雜志》，16:47-51。另外也可以通過消除擴增偏差的計算方法來校正原始數(shù)據(jù)。不過仍然需要采用更好的方法來校正用于擴增子測序多重擴增產(chǎn)生的固有偏差。

提供本背景信息的目的是闡明申請人認為已知的信息與本發(fā)明可能有關(guān)，不必認為也不應(yīng)解釋為上述任何信息是依照本發(fā)明推衍的現(xiàn)有技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在探索一種新的擴增偏差校正方法。采用一種計算方法消除多重PCR擴增過程中由于3′端穩(wěn)定性、引物解鏈溫度(Tm)、擴增子長度、擴增子GC含量、擴增子側(cè)翼區(qū)GC含量差異等因素引起的擴增偏差。

一方面，本發(fā)明涉及了擴增偏差的校正方法，其步驟為：

a)擴增靶核酸；

b)獲取靶核酸擴增子覆蓋數(shù)據(jù)；

c)計算各靶核酸測試基因組區(qū)域和參考基因組區(qū)域之間的擴增子覆蓋度比值；

d)去除異常值；

e)根據(jù)公式歸一化各靶核酸測試基因組區(qū)域和參考基因組區(qū)域之間的擴增子覆蓋度比值，公式為：

f)計算測試基因組區(qū)域擴增子和參考基因組區(qū)域擴增子之間各項參數(shù)的差值，包括引物3′端穩(wěn)定性(Diff_{3′端穩(wěn)定性})、引物解鏈溫度(Diff_Tm)、擴增子長度(Diff_{擴增子長度})、擴增子GC含量(Diff_擴增子GC)和擴增子側(cè)翼區(qū)GC含量(Diff_{擴增子側(cè)翼GC})；

g)根據(jù)公式擬合數(shù)據(jù)，得到回歸參數(shù)值A(chǔ)₁、A₂、A₃、A₄和A₅，公式為：log(歸一化覆蓋度比值)＝

A₁×Diff_{3′端穩(wěn)定性}+A₂×Diff_Tm+A₃×Diff_{擴增子長度}+A₄×Diff_擴增子GC+A₅×Diff_{擴增子側(cè)翼GC}；

h)使用回歸參數(shù)值A(chǔ)1、A2、A3、A4和A5校正擴增偏差，得到去除擴增偏差后的歸一化擴增子覆蓋度比值。