[發明專利]構建測序文庫

在審

• 申請號: 201780090660.5
• 申請日: 2017-03-20
• 公開（公告）號: CN110914449A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發明（設計）人: 楊亮;馮駿;張海川
• 申請（專利權）人: 賽雷納（中國）醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 成都欣圣知識產權代理有限公司 51292
• 代理人: 王海文;王淇

本發明提供了制備測序文庫的方法和成分。該方法和成分能夠使用多重PCR，制備二代測序文庫，并減少引物二聚體的形成。

技術領域

本發明涉及測序文庫的構件，尤其涉及一種采用多重PCR構建二代測序文庫的技術，該技術同時可減少引物二聚體的形成。

背景技術

二代測序(NGS)或大規模平行測序所使用的文庫是由多重聚合酶鏈反應(PCR)構建而成的。測序文庫的構建過程會顯著影響測序數據的質量和輸出。現有的二代測序文庫構建方法存在耗時、易于丟失大量樣本和形成引物二聚體等缺點，從而導致對待測序遺傳物質的低覆蓋率。

因此，需要更好的構建測序文庫的方法。由其需要一種能夠減少引物二聚體形成地、以多重PCR為基礎的文庫構建方法。

提供本背景信息的目的是闡明申請人認為已知的信息與本發明可能有關，不必認為也不應解釋為上述任何信息是依照本發明推衍的現有技術。

發明內容

本發明通過改進二代測序建庫實驗流程減少了超高重PCR引物二聚體形成。本發明的方法和成分降低了與NGS文庫制備、DNA樣本利用率相關的成本。

在某些實施方案中，本發明提供了一種構建二代測序文庫的方法，該方法包括：a)提供包含核酸的樣本，該樣本所含部分核酸中應具有靶核酸序列；b)富集步驟a)所述的靶核酸序列；c)針對靶核酸序列進行第一次多重PCR以獲得擴增子；d)對步驟c)所得樣品進行富集以獲得目標擴增子；e)對所述目標擴增子、測序接頭和barcode進行第二次多重PCR以獲得帶有barcode的目標擴增子，從而構建二代測序文庫。

在某些實施例中，本發明提供的構建二代測序文庫的方法包括：a)提供包含核酸的樣本，該樣本所含部分核酸中應具有靶核酸序列；b)富集步驟a)所述的靶核酸序列；c)針對靶核酸序列進行第一次多重PCR以獲得擴增子；d)對步驟c)所得樣品進行富集以獲得目標擴增子；e)對所述目標擴增子、測序接頭和barcode進行第二次多重PCR以獲得帶有barcode的目標擴增子；f)富集步驟e)所述的帶有barcode的目標擴增子，從而構建二代測序文庫。

在某些實施例中，靶核酸序列包括1～300個核苷酸。在某些實施例中，富集步驟包括使樣本與磁珠接觸，其中所述磁珠結合到樣本中的靶核酸序列；以及從剩余樣本中分離結合到所述磁珠的靶核酸序列。在某些實施例中，第一次或第二次多重PCR包括多個引物對和熱啟動聚合酶。在某些實施例中，引物對包括通用序列和目標序列。在某些實施例中，擴增子包括通用序列和目標序列。在某些實施例中，富集步驟包括將擴增子應用到過濾器上，其中過濾器保留大量擴增子，但允許未消耗引物和引物二聚體通過過濾器。在某些實施例中，過濾器是PCR產物過濾器。在某些實施例中，富集步驟包括將擴增子、引物二聚體和/或未消耗引物應用到過濾器上，以提供過濾純化擴增子、引物二聚體和/或未消耗引物，并使所述過濾純化擴增子、引物二聚體和/或未消耗引物與磁珠接觸，其中所述磁珠結合到所述過濾純化擴增子；以及從未結合到所述磁珠的引物二聚體和/或未消耗引物中分離結合到所述磁珠的過濾純化擴增子。

在某些實施例中，第二次多重PCR采用正向引物和下游引物。在特定實施例中，下游引物具有測序接頭和通用序列。在某些實施例中，下游引物具有測序接頭、barcode和通用序列。在某些實施例中，正向引物包括測序接頭和通用序列。在某些實施例中，正向引物具有測序接頭、barcode和通用序列。在某些實施例中，富集操作所采用的方法包括使用磁珠在含有帶有barcode的目標擴增子、引物二聚體和/或未消化引物的樣品中結合所述帶有barcode的目標擴增子后自剩余物中分離。