[發明專利]表達靶向CDK9的RNAi效應子的H-1 PV

在審

• 申請號: 201780083500.8
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN110337494A
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 卡倫·涅托;吉恩·羅默拉爾;芭芭拉·魯什;彼得·克拉默;李敏;安娜-葆拉·德奧利韋拉;安東尼奧·馬奇尼;李俊偉
• 申請（專利權）人: 上海微知卓生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/864
• 代理公司: 成都超凡明遠知識產權代理有限公司 51258
• 代理人: 劉書芝;洪玉姬

本發明涉及表達針對CDK9基因的RNAi效應子(優選shRNA)的創新的原細小病毒(PV)，其顯示出改善的抗癌活性。這些新病毒基于ΔH?1PV沉默子平臺，該平臺由原細小病毒H?1PV組成，其特征在于NS區域內的框內缺失(ΔH?1PV)并且攜帶shRNA表達盒，其中shRNA的表達受H1聚合酶III啟動子控制。在本發明中，發明人旨在使用ΔH?1PV沉默子來沉默CDK9基因，該基因的活性通常在癌細胞中失調并且已知有助于腫瘤發生。本發明還提供了包括所述細小病毒的細胞或生物體。

技術領域

本發明涉及表達針對CDK9基因的RNAi效應子(優選shRNA)的創新的原細小病毒(protoparvoviruses，PV)，其顯示出改善的抗癌活性。這些新病毒基于ΔH-1PV沉默子平臺，該平臺由原細小病毒H-1PV組成，其特征為NS區域內的框內缺失(ΔH-1PV)并且攜帶RNA表達盒，優選shRNA 表達盒，在該表達盒中RNA的表達受H1聚合酶III啟動子控制。在本發明中，發明人旨在使用ΔH-1PV沉默子來沉默CDK9基因，該基因的活性通常在癌細胞中失調并且已知有助于腫瘤發生。本發明還提供了包括所述細小病毒的細胞或生物體。

背景技術

RNAi干擾，RNAi效應子和遞送

RNA干擾(RNAi)首次被Andrew Fire和Craig Mello在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中識別出來，之后因其發現他們在1998年被授予諾貝爾獎。RNAi的機制基于借助于與靶序列互補的雙鏈RNA的宿主 mRNA的序列特異性降解。RNAi是一種控制基因表達的天然存在的細胞過程，因此在許多細胞過程中起著關鍵作用，包括發育過程[1]。它也是免疫應答的重要組成部分，保護細胞免受如病毒和轉座子等病原體的侵害[2]。在其發現后不久，RNAi技術被用于解決生物學問題和疾病的治療選擇，因為它具有高度的特異性和能力，以實現有效地敲除已知的基因序列[3]。在治療上，RNAi通過遞送小RNA雙鏈體來起作用，包括微小RNA(miRNA) 模擬物、小干擾RNA(siRNA)、短發夾RNA(shRNA)和Dicer底物RNA (dsiRNA)[4]。所有這四類RNAi效應子目前都在針對包括多種癌癥在內的各種疾病的多個I-III期臨床試驗中進行了測試[5]。

通過RNAi介導的抗癌療法靶向的基因的實例是KRAS、Polo樣激酶1、弗林蛋白酶、Ephrin A型受體和c-myc。大多數臨床研究涉及與納米顆粒(例如脂質納米顆粒)綴合的siRNA，其與裸siRNA相比具有優異的穩定性。然而，盡管有顯著改善，但在注射后的前72小時內觀察到siRNA的快速下降，其中大多數siRNA被肝細胞吸收(從注射開始30分鐘后已在肝臟中發現注射劑量的大約50％)。因此，siRNA的有效遞送仍然是該領域的主要瓶頸[5]。由于大多數遞送系統是瞬時的并且在細胞分裂期間siRNA的細胞內濃度被稀釋，因此通常需要重復給予siRNA。

短發夾RNA(shRNA)是另一類RNAi效應子[6]。shRNA通常由兩個互補的(正義和反義)19-29個堿基對序列組成，所述序列由4-11個受損核苷酸的短莖環(loop)分開。通常，表達受RNA聚合酶(Pol)III啟動子 (例如U6、H1)或修飾的pol II啟動子控制。轉錄shRNA后，通過莖環連接的正義鏈和反義鏈成對一起形成特征性發夾結構。該結構類似于細胞天然用于調節基因表達并需要核處理的前miRNA(pre-miRNA)[3]。在發現啟動子驅動的shRNA表達后，病毒RNAi載體的設計成為可能[7]。用于在癌癥基因治療中遞送和表達shRNA的病毒的實例是腺病毒、腺相關病毒、慢病毒和逆轉錄病毒。然而，大多數這些病毒在復制方面有缺陷，并因此沉默效應僅限于原代感染細胞。

溶瘤病毒和RNAi