[發(fā)明專利]角膜上皮細(xì)胞群的制造方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780083387.3
• 申請日: 2017-12-27
• 公開（公告）號: CN110168076A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 西田幸二;林龍平;柴田峻
• 申請（專利權(quán)）人: 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K35/30;A61L27/38;A61P27/02
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 張晶;謝順星

本發(fā)明提供一種制造角膜上皮細(xì)胞群的方法，該角膜上皮細(xì)胞群用于制作移植用角膜上皮細(xì)胞片，該方法包括：制備包含角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞群的工序(1)；將工序(1)中制備的細(xì)胞群供于磁性細(xì)胞分離，獲得CD200陰性/SSEA?4陽性細(xì)胞的工序(2)；及使工序(2)中獲得的細(xì)胞與選自由具有α3鏈的層粘連蛋白、具有α4鏈的層粘連蛋白及具有α5鏈的層粘連蛋白組成的組中的層粘連蛋白或其E8片段接觸，獲得粘附細(xì)胞的工序(3)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種角膜上皮細(xì)胞群的制造方法，涉及一種用于移植用角膜上皮細(xì)胞片的制作的高純度角膜上皮細(xì)胞群的制造方法。

背景技術(shù)

角膜上皮細(xì)胞位于眼的最外層，起到對外界的防護(hù)功能等重要的功能。作為頑固的眼疾的一組，已知有作為角膜上皮干細(xì)胞缺損癥的Stevens-Johnson綜合癥、眼類天皰瘡、堿腐蝕等疾病。在角膜上皮干細(xì)胞缺損癥中，因由外傷或自身免疫等造成的慢性炎癥反應(yīng)，存在于眼的角膜緣的角膜上皮干細(xì)胞陷入不可逆的功能不全、或消失，從而呈現(xiàn)角膜混濁的癥狀。作為其結(jié)果，眼的結(jié)膜上皮侵入角膜中央部，由此角膜失去本來所具有的透明性，導(dǎo)致顯著的視力下降。作為用于恢復(fù)角膜上皮干細(xì)胞缺損癥等嚴(yán)重的角膜疾病患者的視力的措施，一直以來施行角膜移植術(shù)。特別是對于雙眼發(fā)病的雙眼性的患者而言，現(xiàn)狀是由于不存在來自患者本人的正常角膜，因此僅能夠施行異體角膜移植術(shù)。然而，由于施行異體角膜移植術(shù)時，存在能夠供給所需角膜的供體不足的問題、或存在對來自供體的角膜產(chǎn)生排斥反應(yīng)的問題，因此期望開發(fā)使用自體細(xì)胞源的治療法。

作為針對角膜上皮干細(xì)胞缺損癥等嚴(yán)重的角膜疾病的新型治療法，本申請的發(fā)明人開發(fā)了由iPS細(xì)胞制作角膜上皮細(xì)胞片的技術(shù)，并使用動物模型確認(rèn)了其有效性(非專利文獻(xiàn)1)。由于通過非專利文獻(xiàn)1中記載的分化誘導(dǎo)法、由iPS細(xì)胞生成的細(xì)胞為包括眼周圍的各種細(xì)胞的細(xì)胞群，因此為了用于角膜上皮細(xì)胞片的制作，需要純化角膜上皮細(xì)胞。因此，非專利文獻(xiàn)1中，使用針對角膜上皮細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體，利用FACS分選進(jìn)行純化。

FACS分選為利用液流使進(jìn)行了抗體染色的細(xì)胞流動，通過激光的照射確認(rèn)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)并分揀特定的細(xì)胞的技術(shù)，但是難以保證細(xì)胞通過的全部流路的無菌性，存在可能有細(xì)胞污染的問題。并且，F(xiàn)ACS分選存在回收后的細(xì)胞的損傷大的問題。進(jìn)一步，F(xiàn)ACS分選所使用的機(jī)器的維修需要專業(yè)的知識和技術(shù)。因此，在大量地制備用于移植用角膜上皮細(xì)胞片的制作的細(xì)胞的情況下，F(xiàn)ACS分選不一定是理想的方法，將非專利文獻(xiàn)1的技術(shù)實用化及產(chǎn)業(yè)化時仍留有技術(shù)問題。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Hayashi?et?al.,Nature.2016Mar?17；531(7594):376-80.doi:10.1038/nature17000.Epub?2016Mar?9.

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明的技術(shù)問題在于，提供一種不使用FACS分選，通過短時間且簡便的操作，由包含角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞群大量制造能夠在移植用角膜上皮細(xì)胞片的制作中使用的高純度且安全、損傷少的角膜上皮細(xì)胞群的方法。

解決技術(shù)問題的技術(shù)手段

為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明包括以下的發(fā)明。

[1]一種制造用于制作移植用角膜上皮細(xì)胞片的角膜上皮細(xì)胞群的方法，其特征在于，其包括以下的工序(1)～(3)：

(1)制備包含角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞群的工序；

(2)將工序(1)中制備的細(xì)胞群供于磁性細(xì)胞分離，獲得CD200陰性/SSEA-4陽性細(xì)胞的工序；及

(3)使工序(2)中獲得的細(xì)胞與選自由具有α3鏈的層粘連蛋白、具有α4鏈的層粘連蛋白及具有α5鏈的層粘連蛋白組成的組中的層粘連蛋白或其E8片段接觸，獲得粘附細(xì)胞的工序。