[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因動物和生物生產(chǎn)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780081794.0
• 申請日: 2017-12-29
• 公開（公告）號: CN110177878A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: R·雁如·蔡;徐捷;陳育慶;張繼峰;孔令潔
• 申請（專利權(quán)）人: 應(yīng)用干細(xì)胞有限公司;密歇根大學(xué)董事會
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K14/00;C12N15/85
• 代理公司: 北京市君合律師事務(wù)所 11517
• 代理人: 張怡;杜丹

本申請?zhí)峁┝税^定DNA序列的遺傳修飾的非人哺乳動物，所述錨定DNA序列插入泌乳蛋白基因的內(nèi)源基因座處，其中所述錨定DNA序列包含位點特異性重組酶識別位點。還提供了包含轉(zhuǎn)基因的遺傳修飾的非人哺乳動物，所述轉(zhuǎn)基因插入泌乳蛋白基因的內(nèi)源基因座處，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼分泌性蛋白并且與所述泌乳蛋白基因的內(nèi)源啟動子可操作地連接，并且其中所述轉(zhuǎn)基因側(cè)接一對位點特異性重組酶重組后位點。所提供的遺傳修飾的非人哺乳動物可用于從其所產(chǎn)生的乳中產(chǎn)生分泌性的重組蛋白，所述分泌性的重組蛋白由所述轉(zhuǎn)基因編碼。

對相關(guān)申請的引用

本申請要求2016年12月29日提交的美國臨時專利申請62/439,896的優(yōu)先權(quán)。其全部內(nèi)容在此參考并入。

基金信息

本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院授予的基金號GM110822的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明主要涉及遺傳修飾的非人哺乳動物。更具體地，本發(fā)明涉及遺傳修飾的非人哺乳動物，其包含編碼可經(jīng)由乳汁(milk)分泌的蛋白質(zhì)的基因，以及產(chǎn)生這種非人哺乳動物的方法。

背景技術(shù)

生物生產(chǎn)是生產(chǎn)基于生物制劑的治療性藥物，例如基于蛋白質(zhì)的治療劑如抗體和疫苗，其非常復(fù)雜以至于它們必須在生命系統(tǒng)中制得。已經(jīng)采用了多種方法進(jìn)行生物生產(chǎn)，包括微生物、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞的培養(yǎng)，和從天然來源如血液和牛奶中純化。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)的組合，可以產(chǎn)生將靶蛋白分泌到乳中的轉(zhuǎn)基因動物，然后從乳汁中純化出靶蛋白(參見，例如，Gordon等人的美國專利7,045,676和7,939,317)。從乳汁中進(jìn)行的生物生產(chǎn)的優(yōu)勢包括將單位成本降低5-50倍(使用動物乳時每種蛋白質(zhì)每克為2-20美元，而使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)則為100美元)、技術(shù)要求低(同一個動物可以連續(xù)生產(chǎn)乳汁，而細(xì)胞培養(yǎng)需要不斷地監(jiān)測和取樣)、復(fù)雜蛋白質(zhì)的生產(chǎn)(動物自然攜帶生產(chǎn)復(fù)雜蛋白質(zhì)所需的細(xì)胞機制，而這些復(fù)雜蛋白質(zhì)即使有可能在細(xì)胞培養(yǎng)物中得到復(fù)制，那也是非常困難的)以及容易從乳汁中純化出蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)能有效地從乳汁中通過，平均產(chǎn)率為53％，純度為99％)。生物生產(chǎn)的市場近年來發(fā)展迅速。在歐盟和美國，被批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因動物生物生產(chǎn)的實例包括在轉(zhuǎn)基因山羊的乳汁中表達(dá)的Atryn(抗凝血酶，由LBF生產(chǎn))(2006年在歐洲批準(zhǔn)，2009年在美國批準(zhǔn))和在轉(zhuǎn)基因兔的乳汁中表達(dá)的Ruconest(C1抑制劑，由Pharming Group生產(chǎn))(2010年在歐洲批準(zhǔn)，2016年在美國批準(zhǔn))。鑒于對治療性蛋白質(zhì)需求的增加以及市場占有率的競爭，需要改進(jìn)生物生產(chǎn)的技術(shù)。

發(fā)明概述

在一個方面，本公開提供了遺傳修飾的非人哺乳動物，其包含插入泌乳蛋白基因的內(nèi)源基因座處的錨定DNA序列，其中所述錨序列包含第一位點特異性重組酶識別位點。在某些實施方案中，所述錨定DNA序列還包含第二位點特異性重組酶識別位點。在某些實施方案中，所述第一重組酶識別位點與所述第二重組酶識別位點相同。在某些實施方案中，所述第一重組酶識別位點不同于所述第二重組酶識別位點。在某些實施方案中，所述第一位點特異性重組酶識別位點或所述第二位點特異性重組酶識別位點被選自下組的位點特異性重組酶識別：Cre、Flp、λ整合酶、γ-δ解離酶、Tn3解離酶、Sin解離酶、Gin轉(zhuǎn)化酶、Hin轉(zhuǎn)化酶、Tn5044解離酶、IS607轉(zhuǎn)座酶、Bxb1整合酶、wBeta整合酶、BL3整合酶、phiR4整合酶、A118整合酶、TG1整合酶、MR11整合酶、phi370整合酶、SPBc整合酶、TP901-1整合酶、phiRV整合酶、FC1整合酶、K38整合酶、phiBT1整合酶和phiC31整合酶。在某些實施方案中，所述第一或所述第二位點特異性重組酶識別位點為attP。在某些實施方案中，所述第一或所述第二位點特異性重組酶識別位點為attB。在某些實施方案中，所述第一位點特異性重組酶識別位點是phiC31-attP并且所述第二位點特異性重組酶識別位點是Bxb1-attP，或反之亦然。