[發明專利]三維體外肺泡肺模型、所述模型的制備方法以及其用于確定和/或預測可吸入物的致敏效果的用途

在審

• 申請號: 201780081184.0
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN110168075A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 阿林·沙里;阿爾諾·古特萊貝;托馬索·塞爾基;布倫海爾德·布洛梅克
• 申請（專利權）人: 盧森堡理工學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0784;G01N33/50
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 孫微;金小芳

本發明涉及一種三維體外肺泡肺模型，其基本上包括如下四種細胞類型：能夠分泌(肺部鋪設)表面活性物質的肺泡II型上皮細胞，構成提供滲透性屏障的毛細血管內襯層的內皮細胞，樹突狀細胞(如未分化的THP?1，連接先天性和適應性免疫)，以及巨噬細胞樣細胞，能夠通過吞噬作用攝入外來物質參與防御機制。本發明還涉及制備所述模型的方法，及其用于評估可吸入物諸如顆?；蚍肿訉Ψ蔚姆闻萜琳系拇碳摿蚨拘裕约坝糜诖_定和/或預測可吸入物諸如顆?；蚍肿訉Ψ蔚姆闻萜琳系闹旅粜Ч挠猛?。

技術領域

本發明涉及一種三維體外肺泡肺模型及所述模型的制備方法。

本發明還涉及其用于評估可吸入物(諸如可吸入顆?；蚍肿?對肺的肺泡屏障的刺激潛力或毒性，以及用于確定和/或預測可吸入物(諸如可吸入顆?；蚍肿?對肺的肺泡屏障的致敏效果的用途和方法。

背景技術

由于接觸化學產品而引起的呼吸道致敏在過去幾十年中增加，導致發病率的增加。例如香料和工業溶劑之類的合成化合物的更廣泛使用，導致我們每天可能接觸到的物質呈指數增長。已知這些物質中的一些會引起呼吸道致敏，這意味著它們會隨著時間的推移引發過敏反應的發展，并可能產生不良的全身性反應。

這可能導致呼吸系統疾病，如哮喘、過敏性鼻炎、鼻結膜炎和鼻竇炎。

為了表征這些化學物質的潛在風險，有必要充分了解肺致敏中所涉及的機制。

在過去，動物研究為了解呼吸道過敏發生中涉及的機制提供了有用的結果。然而，對所涉及的細胞效應的機制理解仍然是有限的。已經提出了幾種方法來區分和鑒定過敏原的功能和結構特征，但這些研究都沒有得出決定性的結果，這主要是由于生物源和環境混雜的輔助因素。這種知識的缺乏阻礙了預測性體外模型的發展，使體內模型成為表征呼吸道過敏原的唯一工具。然而，盡管缺乏確定和表征呼吸道致敏物的有效方法，但諸如REACH(化學品的注冊、評估、授權和限制)的法規要求并鼓勵使用非動物方法進行毒理學評估。

目前，還沒有一種經過驗證的體外方法，可以作為體內測試的替代方法，并能夠識別和表征作為呼吸道致敏物的化學物質的潛力。

在2013年的出版物(Klein等，微粒和纖維毒理學報，2013，10:31)中，作者提出了由肺泡II型上皮細胞系(A459)、分化巨噬細胞樣細胞(THP-1)、肥大細胞(HMC-1)和內皮細胞(EA.hy 926)組成的四培養物(tetraculture)模型，這使得模型能夠暴露于氣-液界面(ALI)。然而，觀察到細胞在浸沒條件下形成異質菌落：這導致過高估計在例如ROS(活性氧類)產生和IL-8分泌的結果中觀察到的效果。此外，Klein的模型由于缺乏相關的感受態細胞而不能用于致敏作用的評價，且由于孔徑尺寸減小而不允許細胞通過膜遷移。與培養箱對照相比，ALI處的暴露對培養物具有引發效應，其呈現更高的基礎氧化應激水平。這對于提供毒理學效應更現實估計的外部挑戰給出一個更生理學的答案。此外，ALI處的暴露允許對于外源性化合物的現實接觸，無需在包含許多會與研究中的化學物質相互作用的生物分子的細胞培養基中的前稀釋，由此可能改變生物效應的讀數，導致不可預知的低估或高估的生物效應。

迄今為止提出的用于呼吸毒理學的所有先前模型通常使用支氣管細胞系制成，與呼吸道致敏的背景無關。因此，需要一個相關的工具來研究呼吸道致敏并預測可吸入化學物質和小顆粒的呼吸潛力。

發明目的

本發明的第一個目的是提供一種模擬肺的肺泡表面的體外模型，以評估可吸入物、化學物質以及顆粒的呼吸道致敏潛力。

發明內容

本發明涉及一種三維體外肺泡肺模型，主要包括以下四種細胞類型：

a)能夠分泌(肺部鋪設)表面活性物質的肺泡II型上皮細胞，

b)構成提供滲透性屏障的毛細血管內襯層的內皮細胞，