[發明專利]蛋白質篩選和檢測方法

在審

• 申請號: 201780080285.6
• 申請日: 2017-10-30
• 公開（公告）號: CN110225973A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: M.西格;P.埃格洛夫;I.茲梅曼
• 申請（專利權）人: 蘇黎世大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/62;G01N33/68;C07K16/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;龐立志

1.一種從多肽文庫篩選多肽的方法，所述方法包括下述步驟：

a. 提供第一核酸文庫，其中所述第一核酸文庫的各成員包含編碼第一多肽文庫的成員的多肽編碼序列；

b. 提供第二核酸文庫，其中所述第二核酸文庫包含多個成員，其中各成員包含編碼檢測標記的標記編碼序列，其中所述檢測標記：

i. 通過氨基酸序列表征，所述氨基酸序列不同于由所述第二核酸文庫編碼的任何其他檢測標記的氨基酸序列；

ii. 通過200 Da和5000 Da之間、特別500 Da和2500 Da之間、更特別約900 Da和2200Da之間的分子量來表征；以及

iii. 包含第一可切割元件；

c. 將所述第一核酸文庫的所述成員中包含的所述多肽編碼序列插入所述第二核酸文庫的成員中，由此生成標記核酸文庫，所述標記核酸文庫編碼標記多肽文庫，其中所述標記多肽文庫的各成員包含多肽和檢測標記，所述檢測標記與所述多肽通過所述第一可切割元件分離；

d. 從所述標記核酸文庫獲得多個核酸序列，其中所述多個核酸序列中的各序列包含多肽編碼序列和標記編碼序列；

e. 對于步驟d中獲得的標記編碼序列所編碼的各檢測標記預測質譜分析裂解模式；

f. 從所述標記核酸文庫表達所述標記多肽文庫；

g. 在篩選步驟中篩選所述標記多肽文庫的成員，產生所篩選的多肽；

h. 切割所述第一可切割元件，由此，將所述檢測標記與所述篩選的多肽分離，產生分離的檢測標記；

i. 以下述方式對所述分離的檢測標記進行鑒定：

i. 通過質譜分析記錄所述分離的檢測標記的裂解模式；

ii. 將步驟i中獲得的所述裂解模式與步驟e中預測的所述裂解模式匹配，由此鑒定所述分離的檢測標記；

j. 從步驟d中獲得的所述多個核酸序列，篩選包含編碼步驟i中所鑒定的所述檢測標記的標記編碼序列的核酸序列，由此鑒定與步驟i中鑒定的所述檢測標記締合的所述標記多肽文庫的成員。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述分離的檢測標記通過－27和128之間、特別－1和70之間的疏水性值來表征。

3.根據上述權利要求任一項所述的方法，其中所述標記多肽文庫的所述成員與親和標記締合，所述親和標記特別選自His標記、CBP標記、CYD標記、Strep標記、StrepII標記、FLAG標記、HPC標記、GST標記、Avi標記、生物素化標記、Myc標記、3xFLAG標記以及MBP標記。

4.根據上述權利要求任一項所述的方法，其中所述檢測標記與親和標記締合，所述親和標記特別選自His標記、CBP標記、CYD標記、Strep標記、StrepII標記、FLAG標記、HPC標記、GST標記、Avi標記、生物素化標記、Myc標記、3xFLAG標記以及MBP標記。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述親和標記與所述檢測標記通過第二可切割元件分離，所述第二可切割元件在步驟i前被切割。

6.根據上述權利要求任一項所述的方法，其中步驟i包括通過與電噴霧電離質譜偶聯的液相色譜（LC-MC）分析所述分離的檢測標記。

7.根據上述權利要求任一項所述的方法，其中步驟d包括以≥ 5x的覆蓋區對所述完整的標記表達文庫進行測序。

8.根據上述權利要求任一項所述的方法，其中所述分離的檢測標記由5至30個、特別7至21個、更特別11至15個氨基酸組成，并僅包含一個具有正電荷側鏈的氨基酸。

9.根據上述權利要求任一項所述的方法，其中所述分離的檢測標記包含選自序列元件I的集合的序列元件I，其中所述序列元件I由5至10個、特別7個氨基酸組成，各氨基酸彼此獨立地選自A、S、T、N、Q、D、E、V、L、I、F、Y、W、G以及P。