[發明專利]蛋白質篩選和檢測方法

在審

• 申請號: 201780080285.6
• 申請日: 2017-10-30
• 公開（公告）號: CN110225973A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: M.西格;P.埃格洛夫;I.茲梅曼
• 申請（專利權）人: 蘇黎世大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/62;G01N33/68;C07K16/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;龐立志

本發明涉及一種從多肽文庫對多肽進行鑒定和定量的方法。所述方法包括如下步驟：1、提供多肽文庫和檢測標記文庫；2、生成嵌套文庫，所述嵌套文庫包含所述多肽和所述檢測標記；3、對所述嵌套文庫進行測序；4、在一個或多個獨立于物理基因型?表型連鎖的篩選步驟中篩選所述嵌套文庫的成員；5、從所篩選的多肽中分離所述檢測標記；6、通過質譜分析對所述檢測標記進行鑒定和定量；7、獲得所篩選的多肽的序列。本發明還涉及多肽集合、檢測標記集合以及質粒載體集合。

本發明涉及一種將檢測標記附著于蛋白質文庫和接下來使用所述標記對符合所限定的生物物理學或藥理學標準的蛋白質進行鑒定和定量的方法。

描述。

背景技術

蛋白質篩選和蛋白質展示方法是現有技術對表現某些特征（例如，對于靶分子的高親和力結合）的蛋白質進行鑒定或富集的方法。

在篩選中，逐一分析蛋白質。這是非常費力的，并且限于較低數量的試驗。例如，在結合蛋白的篩選中，通過ELISA鑒定各結合蛋白候選物，進一步表征陽性ELISA命中，例如，通過尺寸排阻色譜、解折疊實驗對其進行生物物理學表征，在動物模型中體內檢測其治療潛能。

在展示方法中，經數輪篩選富集整個蛋白質池（源于文庫）。對于蛋白質池的處理允許無大量勞動情況下的巨大通量。然而，諸如噬菌體、核糖體或酵母菌展示的展示方法需要表型（蛋白質）和基因型（其編碼核酸）之間的物理連鎖。因為進行展示（即，噬菌體、核糖體以及編碼DNA或RNA）所需的物理實體大小通常是實際結合分子（例如抗體片段）的超過100倍，這對于大多數分析來說是嚴重的限制。這不可避免地導致篩選偏差，并將可能的篩選壓力限制到小亞組的可想象的篩選壓力—當前僅不受展示顆粒巨大尺寸嚴重影響的篩選壓力可應用（例如結合）。

基于上述現有技術，本發明的目的是提供在缺乏物理基因型-表型連鎖的情況下從整個蛋白質文庫鑒定符合所限定的生物物理學或藥理學標準的各蛋白質的方式和方法。此目的通過本說明書的權利要求來實現。

術語和定義

本領域技術人員知道，在本說明書范圍內，表示文庫大小的數字涉及文庫成員的多樣性。大于文庫II的文庫I對應于包含比文庫II更多數量的獨特文庫成員的文庫I。具有100.000個成員的核酸文庫可包含數百萬個核酸分子，但是僅100.000個各自由所述文庫中獨特核酸序列表征的獨特文庫成員。相似地，具有1.000個成員的多肽文庫可包含數百萬個多肽分子，但是僅1.000種獨特的多肽文庫成員。表述“文庫的一個成員”涉及可存在于多個相同拷貝的一個特別的文庫成員。

在本說明書上下文中，表述“兩個核酸序列符合讀框”是指第一核酸序列的最后密碼子和第二核酸序列的第一密碼子之間的堿基對數量可被3除盡。

在本說明書上下文中，表述“多肽與檢測標記締合”、“多肽/檢測標記與親和標記締合”分別表示前述兩個成員均包含在一個一級氨基酸序列、即一個連續的多肽鏈中。具體地，所述檢測標記和所述多肽可由一個或多個氨基酸分離。所述檢測標記和所述親和標記也可由一個或多個氨基酸分離。

在本說明書上下文中，表述“可切割元件”涉及易于被化學試劑或酶方式（例如蛋白酶）切割的肽序列。蛋白酶可為序列特異性性（例如凝血酶）或具有有限的序列特異性（例如胰蛋白酶）。可切割元件I和II還可包含在檢測標記或多肽的氨基酸序列內，特別是當檢測標記或多肽的最后氨基酸是K或R的情況。