[發明專利]外來體相關核酸的測序和分析

在審

• 申請號: 201780079166.9
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN110191962A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 約翰·斯科格;斯蒂普特·查克拉波爾蒂;陳大林;邁克爾·瓦倫蒂諾;瓦斯沙特·塔迪戈特拉;羅伯特·基欽;多米尼克·格里姆;于偉
• 申請（專利權）人: 外來體診斷公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;黃希貴

本發明提供了一系列步驟，其制備從細胞外囊泡分離出來的核酸(RNA和/或DNA)，以供測序。這使得各種各樣的RNAs和/或DNAs能夠被有效地檢測到。然后可以使用這些來識別各種屬性，例如基因表達、可變剪接以及檢測體細胞突變和生殖系突變，包括單核苷酸變體(SNV)和結構變化(插入/缺失、融合、倒置)。

相關申請

本申請要求2016年10月21日提交的美國臨時申請號62/410,974和2017年7月25日提交的美國臨時申請號62/536,545的權益，其內容通過引用以其整體結合到本文中。

發明領域

本發明屬于分子生物學技術領域。更具體地說，本發明屬于分子診斷學技術領域。在分子生物學中，以核酸形式存在的分子，例如RNA和DNA，可以從人體樣品材料(如組織和各種生物流體)中分離出來，并通過多種方法進一步分析。

背景

來自生物流體的外來體和其它細胞外囊泡的全面核酸測序，包括RNA測序，有望進行極為敏感的診斷，從而檢測疾病，患者分層和監測治療反應。術語外來體在此用于描述由細胞釋放的任何細胞外膜結合的囊泡。

對于從體外或離體系統分離的外來體內的長RNA載荷，人們基本缺乏了解。以往的調查外來體RNA載荷的研究主要集中在小RNA部分。這些研究中報道的帶注釋的長RNAs的比例相對較小，轉錄覆蓋率較低，這使得許多人得出結論，認為外來體只攜帶蛋白編碼和非編碼RNA的短片段，并對關于其通過外來體調節基因表達和細胞間通訊的潛在功能能力提出了疑問。

目前從細胞外囊泡中分離DNA和/或DNA及核酸(包括至少RNA)的方法包括超速離心、超濾(例如使用100 kDa濾器)、聚合物沉淀技術和/或基于大小的過濾。然而，對替代方法存在需要，所述替代方法高效和有效分離細胞外囊泡，并任選地提取其中所含的核酸，優選細胞外囊泡RNA，以及對其中所含的核酸進行測序，以用于各種應用，包括診斷目的。

因此，對細胞外囊泡內的核酸進行可靠測序和分析仍存在需要。本公開內容涉及這些和其它重要目的。

發明概述

本發明提供了對來自生物樣品的核酸測序的方法，包括提供生物樣品；在足以在捕獲表面上或在捕獲表面內保留無細胞DNA和細胞外囊泡的條件下，使生物樣品與固體捕獲表面接觸；當無細胞DNA和細胞外囊泡在捕獲表面上或在捕獲表面內時，使捕獲表面與溶解試劑接觸，從而從捕獲表面釋放DNA和RNA并產生勻漿；從勻漿中提取DNA、RNA或兩者；選擇性地從勻漿或從提取的DNA、提取的RNA或兩者中除去核糖體DNA或RNA序列；將RNA反轉錄成cDNA；從提取的DNA、反轉錄的cDNA或提取的DNA和反轉錄的cDNA兩者構建雙鏈DNA庫；任選地擴增來自庫的DNA、RNA或DNA和RNA兩者；從cDNA或雙鏈DNA庫中選擇性地富集核酸序列；和對包含cDNA、雙鏈DNA或cDNA和雙鏈DNA兩者的庫進行測序。

在某些實施方案中，該方法還包括在有選擇地除去核糖體DNA或RNA序列之前或之后，用DNase，例如DNase I和/或修飾的DNase I對勻漿、提取的RNA或提取的DNA和RNA進行預處理的步驟。在其它實施方案中，該方法還包括在庫構建過程中的任意一步，從RNA、cDNA、雙鏈DNA選擇性地除去核糖體DNA或RNA序列。

在某些實施方案中，該方法包括同時對來自生物樣品的RNA和DNA進行測序。