[發明專利]外來體相關核酸的測序和分析

在審

• 申請號: 201780079166.9
• 申請日: 2017-10-23
• 公開（公告）號: CN110191962A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 約翰·斯科格;斯蒂普特·查克拉波爾蒂;陳大林;邁克爾·瓦倫蒂諾;瓦斯沙特·塔迪戈特拉;羅伯特·基欽;多米尼克·格里姆;于偉
• 申請（專利權）人: 外來體診斷公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;黃希貴

1.一種對來自生物樣品的核酸進行測序的方法，其包括：

(a) 提供生物樣品；

(b) 在足以將來自生物樣品的無細胞DNA和細胞外囊泡保留在捕獲表面上或在捕獲表面內的條件下，使生物樣品與固體捕獲表面接觸；

(c) 當無細胞DNA和細胞外囊泡在捕獲表面上或在捕獲表面內時，使捕獲表面與溶解試劑接觸，從而從捕獲表面釋放DNA和RNA并產生勻漿；

(d) 從勻漿中提取DNA、RNA或兩者；

(e) 選擇性地從勻漿或從提取的DNA、提取的RNA或兩者中除去核糖體DNA或RNA序列；

(f) 將RNA反轉錄成cDNA；

(g) 從提取的DNA、反轉錄的cDNA或提取的DNA和反轉錄的cDNA兩者，構建雙鏈DNA庫；

(h) 任選地擴增來自庫的DNA、RNA或DNA和RNA兩者；

(i) 從cDNA或雙鏈DNA庫選擇性地富集核酸序列；和

(j) 對包含cDNA、雙鏈DNA或cDNA和雙鏈DNA兩者的庫進行測序。

2. 權利要求1的方法，其還包括在步驟(e)之前或之后，用DNase，例如DNase I和/或修飾的DNase I，預處理勻漿、提取的RNA或提取的DNA和RNA的步驟。

3.權利要求1的方法，其還包括在步驟(e)中，在庫構建過程中的任意一步，選擇性地從RNA、cDNA、雙鏈DNA除去核糖體DNA或RNA序列。

4.任一項前述權利要求的方法，其還包括在步驟(d)之前或之后，向勻漿和/或提取的DNA、提取的RNA或提取的DNA和RNA兩者中添加外源RNA或DNA摻雜劑的步驟。

5.權利要求1的方法，其中步驟(j)是同時對來自生物樣品的RNA和DNA兩者進行測序。

6. 任一項前述權利要求的方法，其還包括在步驟(d)之前或之后，用DNase，例如DNaseI預處理勻漿的步驟，接著在勻漿中添加外源RNA摻雜劑的步驟。

7.任一項前述權利要求的方法，其還包括在步驟(d)之前或之后，將外源RNA或DNA摻雜劑以1:100、1:1000、1:10,000、1:100,000、1:1,000,000、1:10,000,000的稀釋度添加至勻漿和/或提取的RNA、提取的DNA或提取的DNA和RNA兩者中的步驟。

8. 任一項前述權利要求的方法，其中選擇性地除去核糖體RNA、cDNA、雙鏈DNA的步驟包括使用酶試劑例如RNase H或限制性內切酶消化；利用基于雜交的生物素化探針富集和鏈霉抗生物素結合的順磁性珠。

9.任一項前述權利要求的方法，其中從RNA、cDNA和/或雙鏈DNA庫選擇性地富集核酸序列的步驟利用基于PCR的方法、互補寡核苷酸和/或基于雜交的生物素化探針富集和鏈霉抗生物素結合的順磁性珠。

10.任一項前述權利要求的方法，其中RNA、cDNA和/或雙鏈DNA分子用獨特的分子指標(獨特的分子標記、獨特的標識符、隨機條形碼)標記，這使得識別模板、重復數據刪除、糾錯和拷貝數計數成為可能；獨特的分子指標可通過引物退火、銜接子連接和酶法來附接。

11.任一項前述權利要求的方法，其中核酸包含具有超過200個核苷酸，例如超過300個核苷酸或甚至超過500個核苷酸的長RNA。

12. 任一項前述權利要求的方法，其中生物樣品含有少至約0.5 mL的體積，例如約0.5mL-約20 mL、約0.5 mL-約10 mL、約0.5 mL-約5 mL、約0.5 mL-約4 mL或甚至約0.5 mL-約2mL的體積。