[發(fā)明專利]用磁性顆粒分離高純度核酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780077771.2
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN110088282B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·斯特洛埃德;C·霍克斯坦
• 申請（專利權(quán)）人: 恰根有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陶家蓉;錢文宇

本發(fā)明的主題是一種從樣品溶液分離核酸的方法，其中從樣品溶液分離核酸是通過吸附到磁性顆粒，然后通過施加磁場從樣品溶液中分離具有吸附于其上的核酸的磁性顆粒，接著進(jìn)行至少一個(gè)洗滌步驟(w)，包括：(w1)將具有吸附于其上的核酸的磁性顆粒懸浮于洗滌液中，其是水性溶液，其具有小于100mM的總鹽濃度且不含有機(jī)溶劑，(w2)在洗滌溶液中孵育具有吸附于其上的核酸的磁性顆粒，和(w3)從洗滌溶液分離具有吸附于其上的核酸的磁性顆粒。本發(fā)明還涉及使用水性溶液，其具有小于100mM的總鹽濃度且不含有機(jī)溶劑，作為用于洗滌具有吸附于其上的核酸的磁性顆粒的洗滌溶液。

本發(fā)明涉及從樣品溶液分離核酸的方法，其中從樣品溶液分離核酸是通過吸附到磁性顆粒，然后通過施加磁場從樣品溶液中分離具有吸附于其上的核酸的磁性顆粒。本發(fā)明的主題也可以是在這些方法中洗滌緩沖液的用途。

背景技術(shù)

由于DNA或RNA典型存在的復(fù)雜系統(tǒng)，獲得含有對于分子生物學(xué)應(yīng)用而言足夠少的污染物的DNA或RNA相當(dāng)困難。這些系統(tǒng)例如生物樣品，如組織，來自體液例如血液的細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞或人工系統(tǒng)例如瓊脂糖凝膠或PCR反應(yīng)樣品，通常包含相當(dāng)數(shù)量的污染物，在用于分子生物學(xué)過程之前，感興趣的DNA或RNA必須與其分離。

從細(xì)胞獲得DNA或RNA的常規(guī)方案利用將細(xì)胞懸浮在溶液中，用酶和/或化學(xué)物質(zhì)裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞中所含的核酸釋放入得到的裂解物溶液。為了分離RNA，常規(guī)的用于釋放DNA的裂解和溶解過程包括額外的抑制核糖核酸酶和將污染物(包括DNA)與RNA分離的額外手段。

二氧化硅材料包括玻璃顆粒，例如玻璃粉末、二氧化硅顆粒和研磨玻璃纖維濾紙制備的玻璃微纖維以及硅藻土在本領(lǐng)域中與例如離液鹽的水性溶液組合使用，以將DNA與其他物質(zhì)分離，并使DNA適合用于分子生物學(xué)過程。

玻璃顆粒、二氧化硅顆粒、硅膠及以上的混合物已被配制成各種不同形式，以制備能可逆結(jié)合核酸材料的基質(zhì)，核酸材料在結(jié)合誘導(dǎo)劑，例如離液劑等存在下當(dāng)與含有所述材料的介質(zhì)接觸時(shí)吸附在表面。這些基質(zhì)設(shè)計(jì)成在基質(zhì)接觸外力，例如離心力或真空過濾時(shí)仍然維持核酸材料的吸附，從而將基質(zhì)和其上吸附的核酸材料與剩余的介質(zhì)組分分開。然后通常通過使基質(zhì)接觸洗脫溶液(例如水或洗脫緩沖液)從基質(zhì)上洗脫核酸物質(zhì)。許多商業(yè)來源提供基于二氧化硅的基質(zhì)，其設(shè)計(jì)用于離心和/或過濾分離系統(tǒng)(例如來自QIAGEN(恰根，希爾登(Hilden)，德國)的核酸分離系統(tǒng)的和系列)。

已開發(fā)了磁力響應(yīng)性顆粒(本文稱作“磁性顆粒”)及其使用方法，用于分離核酸物質(zhì)。文獻(xiàn)中描述了設(shè)計(jì)用于核酸分離的幾類不同的磁性顆粒，可購自商業(yè)來源。這些磁性顆粒通常歸為兩類，設(shè)計(jì)以可逆地直接結(jié)合核酸物質(zhì)的，以及設(shè)計(jì)以間接(即通過至少一種中間物質(zhì))結(jié)合核酸物質(zhì)的。本文將中間物質(zhì)稱為“標(biāo)記物”。例如，一種常用的標(biāo)記物是生物素化寡核苷酸脫氧胸腺嘧啶(oligo-dT)，與mRNA分子的聚腺苷尾在介質(zhì)內(nèi)形成氫鍵。

直接結(jié)合核酸的磁性顆粒通常基于二氧化硅，例如涂有磁力響應(yīng)性硅氧化物的顆粒(也稱作磁珠，例如以商標(biāo)從恰根,希爾登,德國購得的那些；或以商標(biāo)從普洛麥格(Promega)，麥迪遜(Madison)，美國購得的那些)。在結(jié)合誘導(dǎo)劑(例如離液鹽，如鹽酸胍或異氰酸胍)單獨(dú)或組合結(jié)合添加劑(例如醇，如乙醇等)存在下核酸附著于這些顆粒。在顆粒分離后，如需要可將顆粒溫育在水或具有低離子強(qiáng)度的緩沖液中輕易從顆粒洗脫吸附的核酸。

本領(lǐng)域已知數(shù)種不同的自動(dòng)化分離磁性顆粒的方法。一種方法是將磁性或可磁化裝置(例如桿)插入含有磁性顆粒的介質(zhì)中，使磁性顆粒與磁性或可磁化裝置結(jié)合，和除去磁性或可磁化裝置。另外的方法是將磁性或可磁化裝置置于盛有介質(zhì)和磁性顆粒的容器之空間鄰近處。磁性顆粒與容器壁結(jié)合，可除去介質(zhì)而無需轉(zhuǎn)移磁性顆粒。