[發(fā)明專利]用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)染后分離(EPIC)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780075590.6
• 申請日: 2017-10-06
• 公開（公告）號: CN110050065A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: V·R·凱恩斯;C·德馬里亞;J·維特科
• 申請（專利權(quán)）人: 建新公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種產(chǎn)生表達(dá)靶多肽的生產(chǎn)細(xì)胞的群體的方法，該方法包括：

(a)用編碼一個(gè)或多個(gè)mRNA的一個(gè)或多個(gè)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中該一個(gè)或多個(gè)mRNA編碼可選擇多肽和靶多肽；

(b)在轉(zhuǎn)染2至15天內(nèi)從經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞分離表達(dá)該可選擇多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)染的早期表達(dá)宿主細(xì)胞的子群體；和

(c)擴(kuò)增經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的該子群體，由此產(chǎn)生表達(dá)該靶多肽的生產(chǎn)細(xì)胞的群體。

2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)和(c)各自在無藥物選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行。

3.權(quán)利要求1或2的方法，其進(jìn)一步包含從生產(chǎn)細(xì)胞的該群體分離該靶多肽。

4.權(quán)利要求1或2的方法，其進(jìn)一步包括從該經(jīng)擴(kuò)增的子群體分離一個(gè)或多個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的單宿主細(xì)胞，并培養(yǎng)該一個(gè)或多個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的單宿主細(xì)胞以產(chǎn)生該一個(gè)或多個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的單宿主細(xì)胞的克隆群體。

5.權(quán)利要求4的方法，其中與在步驟(c)獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)染但未克隆的宿主細(xì)胞的穩(wěn)定池相比，該一個(gè)或多個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的單宿主細(xì)胞的克隆群體中的至少一個(gè)產(chǎn)生該靶多肽產(chǎn)量的2倍到30倍提高。

6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中經(jīng)歷(b)中的選擇的經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞含有至少80x 10⁶至120x 10⁶個(gè)細(xì)胞。

7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)中的分離是在轉(zhuǎn)染后不到6天進(jìn)行。

8.權(quán)利要求7的方法，其中步驟(b)中的分離是在轉(zhuǎn)染后2天與4天之間進(jìn)行。

9.權(quán)利要求7的方法，其中步驟(b)中的分離是在轉(zhuǎn)染后2天進(jìn)行。

10.權(quán)利要求7的方法，其中步驟(b)中的分離是在轉(zhuǎn)染后3天進(jìn)行。

11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(c)中的擴(kuò)增之前，經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的該子群體含有0.5x 10⁶至6.0x 10⁶個(gè)細(xì)胞。

12.權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中的擴(kuò)增進(jìn)行4至31天。

13.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中該一個(gè)或多個(gè)載體中的第一載體對編碼該靶多肽的mRNA進(jìn)行編碼，并且該一個(gè)或多個(gè)載體中的第二載體對編碼該可選擇多肽的mRNA進(jìn)行編碼。

14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法，其中編碼該靶多肽的mRNA和編碼該可選擇多肽的mRNA二者編碼于一個(gè)載體上。

15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)中的分離采用磁激活細(xì)胞分選(MACS)、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或ClonePix。

16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中該可選擇多肽是FACS可選擇多肽并且步驟(b)中的分離采用FACS。

17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中該靶多肽和該可選擇多肽形成融合多肽。

18.權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法，其中該靶多肽和該可選擇多肽是由單一多順反子mRNA編碼。

19.權(quán)利要求18的方法，其中該多順反子mRNA包含編碼該可選擇多肽的第一開放閱讀框(ORF)和編碼該靶多肽的第二ORF，其中該第一ORF位于該第二ORF的5'。

20.權(quán)利要求19的方法，其中該第一ORF具有非AUG起始密碼子。