[發明專利]用于生物制品生產的細胞的早期轉染后分離(EPIC)

在審

• 申請號: 201780075590.6
• 申請日: 2017-10-06
• 公開（公告）號: CN110050065A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: V·R·凱恩斯;C·德馬里亞;J·維特科
• 申請（專利權）人: 建新公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

本文提供選擇表達靶多肽的細胞的群體的方法。在一些方面中，本公開文本提供基于經轉染的宿主細胞中可選擇多肽的早期表達來分選并選擇所述宿主細胞的群體的方法。在某些實施方案中，該分選是使用基于該可選擇多肽的熒光激活細胞分選或磁激活細胞分選進行。所述選擇方法可進一步用于生成生產細胞的克隆群體，例如用于目標靶多肽的大規模制造。

相關申請的交叉引用

本申請主張2016年10月7日申請的美國臨時專利申請案第62/405,392號的權益，其全部內容是通過引用并入本文中。

序列表

本申請含有以ASCII格式電子提交并且全文通過引用并入本文中的序列表。在2017年10月5日創建的所述ASCII副本命名為593804_SA9_179CPC_ST25.txt并且大小為15,363字節。

背景技術

選擇生產細胞群體和細胞克隆的方法對于生物制品(例如抗體和融合蛋白)的制造是必不可少的。所述方法通常依賴于使用選擇劑，例如甲氨蝶呤(MTX)或甲硫氨酸砜亞胺(MSX)，以偏向并擴大生物制品的生產。給予選擇劑的方法可影響所選群體的生存力或生長速率，或可對克隆穩定性具有負面影響。所述基于藥物的選擇也可較費時，通常需要多輪選擇以獲得含有適于生物制品制造的克隆的群體。仍需要生成大細胞群體和克隆二者的快速可靠的方法，所述群體和克隆產生對宿主細胞的負面影響較小的高效價生物制品。

發明內容

在一些方面中，本公開文本提供選擇表達靶多肽的細胞群體的方法。如本文所述，研發依賴于在群體轉染后不久對群體進行分選的選擇方法。因此，該方法的特征為針對經轉染載體的早期可檢測表達分離經轉染細胞子群體的步驟。在某些實施方案中，該選擇是基于可選擇多肽的早期表達，所述可選擇多肽與靶多肽不同并且在細胞表面上可檢測。

意外的是，發現本文所述方法比使用兩輪MTX選擇生成池的傳統方法更快，并且比包括單輪MTX選擇在內的傳統MTX擴增生產力更高。

本文所述方法可用于例如生成篩選目標多肽的細胞池(例如在早期臨床研發中和用于生成高效價克隆，其可用于產生小規模和大規模制造的目標多肽)。

因此，在一些方面中，本公開文本提供產生表達靶多肽的生產細胞群體的方法，該方法包含：(a)用編碼一個或多個mRNA的一個或多個載體轉染宿主細胞，其中該一個或多個mRNA編碼可選擇多肽和靶多肽；(b)在轉染后2到15天內，從經轉染的宿主細胞分離表達可選擇多肽的經轉染的早期表達宿主細胞的子群體；和(c)擴增經轉染的早期表達宿主細胞的子群體，由此產生生產細胞群體。

在一些實施方案中，步驟(b)是在無藥物選擇培養基中進行。

在一些實施方案中，步驟(c)是在無藥物選擇培養基中進行。

在一些實施方案中，步驟(b)和步驟(c)各自在無藥物選擇培養基中進行。

在所提供任一種方法的一些實施方案中，該方法進一步包含從經擴增子群體分離靶多肽。

在所提供任一種方法的一些實施方案中，該方法進一步包含從經擴增子群體分離一個或多個經轉染的單宿主細胞和培養該一個或多個經轉染的單宿主細胞以產生該一個或多個經轉染的單宿主細胞的克隆群體。

在所提供任一種方法的一些實施方案中，與在步驟(c)獲得的經轉染但未克隆的宿主細胞的穩定池相比，該一個或多個經轉染的單宿主細胞的克隆群體中的至少一個產生靶多肽產量的2倍到30倍提高。

在所提供任一種方法的一些實施方案中，經歷步驟(b)中的分離的經轉染的宿主細胞含有80-120x 10⁶個細胞。