[發明專利]通過快速LAMP分析進行染色體評估

在審

• 申請號: 201780073612.5
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN110023508A
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發明（設計）人: 塞繆爾·威廉姆斯;克里斯蒂娜·布拉茲尼克
• 申請（專利權）人: 塞繆爾·威廉姆斯;克里斯蒂娜·布拉茲尼克
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 浦彩華;姚開麗

本文披露了確定核苷酸序列相對于其他核苷酸序列在復雜基因組中的豐度的方法。

相關申請的交叉引用

本申請要求2017年10月19日提交的美國臨時申請號62/410,362的權益，將其披露以其整體并入本文。

序列表的并入

名為“LAV0002201US_ST25”的文件中包含的序列表以電子方式隨本文一起提交并通過引用并入本文，該文件如在Microsoft Windows操作系統中測量的為3.83千字節并且創建于2017年10月19日。

技術領域

本文披露了確定核苷酸序列相對于其他核苷酸序列在復雜基因組中的豐度的方法。

背景技術

染色體完整性是胚胎、胎兒和新生兒發病率和死亡率的最重要決定因素。因此，對非整倍性、拷貝數變異(CNV)和遺傳性別進行測試對于通過體外受精(IVF)產生的胚胎植入前遺傳篩查(PGS)、產前檢查、心臟或形態異常和外生殖器性別不清的新生兒檢查以及妊娠丟失后妊娠物的評價是至關重要的。

對非整倍性、CNV和遺傳性別進行測試的現有方法包括G帶核型分析、多重連接依賴性探針擴增(MLPA)、微陣列分析、熒光原位雜交(FISH)和下一代測序(NGS)。不幸的是，這些方法需要一體化高復雜性實驗室，價格昂貴，并且不能在資源貧乏的環境中進行。另外，它們需要超過24小時才能完成，從而增加了焦慮，并且可能延遲或者甚至妨礙診斷和治療。

環介導的等溫擴增(LAMP)是一種相對較新的技術，其使用特異性引物和具有高鏈置換和復制活性的DNA聚合酶，在一步過程中在等溫條件下快速擴增特定DNA靶標。通過將DNA擴增與報告系統結合，可以檢測靶序列的存在。反應在恒定溫度(通常為60℃-65℃)下發生，消除了對昂貴熱循環儀的需要。由于擴增反應的性質并且不需要在反應溫度之間循環，因此在短至10-15分鐘內快速發生擴增。由于引物用于識別六種不同的DNA靶序列，因此反應非常具特異性。

因為該系統穩健、快速且成本低廉，因此已經開發了多種基于LAMP的測定，用于即時檢測微生物(包括病毒、細菌和真菌)、食品質量控制、腫瘤檢測以及牛胚胎和法醫樣品的性別鑒定。本披露描述了基于定量LAMP的測定(qLAMP)并且展示了其在人類胚胎性別鑒定和人類臨床樣品非整倍性測定中的應用。

發明內容

在一個實施例中，本披露描述了一種分析一種或多種核酸模板的方法，該方法包括：a)提供多重反應混合物，其包含：(i)至少一種待擴增的核酸模板，(ii)至少一種核酸靶標，(iii)用于擴增該核酸模板的引物，和(iv)用于擴增該核酸靶標的引物；b)用聚合酶共擴增該復雜模板核酸和該核酸靶標，其中該共擴增等溫地發生并且包括至少94℃的熱脈沖步驟，其中核酸模板和核酸靶標被擴增；c)使該核酸模板歸一化，其中在完成步驟b)的共擴增后進行該歸一化。

在另一個實施例中，總擴增的對照核酸的量和總核酸模板的量與該核酸模板的完整擴增相關，其中該共擴增步驟等溫地進行。

在又另一個實施例中，該等溫共擴增步驟包括但不限于基于核酸序列的擴增(NASBA)、環介導的擴增(LAMP)、解旋酶依賴性擴增(HDA)、滾環擴增(RCA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)和多重置換擴增(MDA)。

在另一個實施例中，本文披露的方法可以用于對非整倍性、拷貝數變異(CNV)和遺傳性別進行測試。

在另一個實施例中，本文披露的方法可以用于病原體檢測。

在另一個實施例中，該一種或多種核酸模板和/或該核酸靶標是人類染色體。

在又另一個實施例中，該人類染色體是1號染色體或21號染色體。