[發明專利]基因型分型測定中的非獨特條形碼

在審

• 申請號: 201780069559.1
• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN110023509A
• 公開（公告）日: 2019-07-16
• 發明（設計）人: M·索森;V·沃克里斯科;L·迪亞斯
• 申請（專利權）人: 私人基因診斷公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G16B20/20;C40B40/06;C40B50/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 王永偉;趙蓉民

本公開涉及ctDNA測定，其以高精確性和準確性從單個樣本中查詢多個區域，同時評估包括序列突變和結構改變的多種形式的癌癥相關的基因組改變。本公開提供了通過使用有限的非獨特條形碼池與內源條形碼組合分析癌癥基因來實現高靈敏性和特異性的簡化但穩健的方法。使用高覆蓋率下一代測序捕獲并測序樣本，以允許識別腫瘤特異性體細胞突變、擴增和易位。

相關申請(一個或多個)的交叉引用

本申請要求2016年11月15日提交的美國臨時申請序號62/422,355的權益和優先權，其內容以其整體通過引用并入本文。

技術領域

本發明總體上涉及用于分析腫瘤特異性生物標志的核酸的條形碼化(barcoding)策略。

背景技術

僅在美國，癌癥每年導致多于五十萬人死亡。目前治療的成功取決于癌癥的類型及其被檢測到時的分期。多種治療包括昂貴且痛苦的手術和化學療法，并且通常是不成功的。

突變的早期且準確檢測對于有效的癌癥治療是必要的。個人化癌癥治療中的一個有前景的領域是分析循環腫瘤DNA(ctDNA)。ctDNA從腫瘤組織釋放到血液中，攜帶腫瘤特異性基因改變，并且可以通過非侵入性液體活組織檢查方法進行分析，以識別癌癥患者中的基因改變。液體活組織檢查提供了相當大的優勢，因為它們可以消除對侵入性程序的需要，允許治療反應的早期測量，并且允許在治療過程中檢測多個轉移性病灶的改變。

然而，由于當前基因型分型技術的限制，查詢(interrogate)血液中的ctDNA一直有問題。從血液樣本中獲得的ctDNA的分數通常非常低(<1.0％)并且可能難以檢測。大多評估ctDNA的方法查詢單個熱點突變或僅一些基因改變。在無細胞DNA(游離DNA，cell-freeDNA)中的常規基因型分型具有約1％的錯誤率，這使得難以或不可能使用常規分子條形碼化技術識別樣本中具有<1％流行率(普遍性，prevalence)的突變。目前的方法不提供足夠的分析靈敏性和特異性。

發明內容

本公開涉及ctDNA測定，其以高精確性和準確性從單個樣本查詢多個基因組區域，同時評估包括序列突變和結構改變的多種形式的癌癥相關基因組改變。本公開提供了通過利用有限的非獨特條形碼池與內源條形碼組合分析癌癥基因來實現高靈敏性和特異性的簡化但穩健的方法。使用高覆蓋率下一代測序(high coverage next-generationsequencing)來捕獲并測序，以允許識別腫瘤特異性體細胞突變和易位。針對序列突變或重排的分析可以一起或單獨進行——取決于目標的具體改變。所公開的方法針對診斷、法醫、系譜和臨床目的提供了增加的測序靈敏性和特異性。

所公開的方法尤其適于適應(accommodating)低豐度樣本DNA，如在液體活組織檢查中。液體活組織檢查評估血液中DNA的循環腫瘤DNA。循環腫瘤DNA(ctDNA)可以通過腫瘤細胞的凋亡進入血流，并且當被檢測到時，允許診斷、基因型分型和疾病監測，而無需傳統的侵入性活組織檢查程序。然而，ctDNA水平總體上非常低，尤其是對于早期腫瘤，這使得其難以依賴ctDNA進行檢測和分析。本發明用識別含有限量DNA模板的樣本中的稀有突變的方法解決了此問題。本發明的方法降低了大規模平行測序儀器中固有的錯誤率的影響(effect)。沒有本公開的方法，那些儀器中固有的錯誤率通常太高而不能識別多數樣本中的稀有突變。

方法可包括從血漿樣本中提取和分離無細胞DNA，并將外源條形碼分配至每個片段以產生DNA文庫。外源條形碼來自有限的非獨特條形碼池，例如8種不同的條形碼。條形碼化的片段基于它們的外源條形碼和由每個無細胞DNA分子的片段末端的基因組位置產生的內源條形碼的組合而被分化。DNA文庫被冗余測序，并協調(調整，reconcile)具有匹配條形碼的序列。將協調的序列與人類基因組參考比對，并將比對序列中存在的變體識別為真實突變。