[發(fā)明專利]用于多重檢測(cè)甲基化DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780069147.8
• 申請(qǐng)日: 2017-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN109952381B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 安城皖;吳泰禎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 基因特力株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 陳桉

本發(fā)明涉及一種用于多重檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法和一種用于檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的組合物，并且更具體地，涉及一種用于通過(guò)如下方式檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法：構(gòu)建包含能夠與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不能夠與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物的寡核苷酸，用該寡核苷酸充當(dāng)引物對(duì)該靶標(biāo)DNA進(jìn)行線性擴(kuò)增，并通過(guò)能夠與該線性擴(kuò)增的DNA互補(bǔ)結(jié)合的該寡核苷酸、該通用引物和探針對(duì)該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開文本涉及一種用于多重檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法和一種用于檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的組合物，并且更具體地，涉及一種用于檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化的方法，其包括：構(gòu)建寡核苷酸，其包含能夠與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和與靶標(biāo)DNA不互補(bǔ)的人工引物；通過(guò)使用該寡核苷酸作為初級(jí)引物對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行線性擴(kuò)增用于線性靶標(biāo)富集(下文稱為L(zhǎng)TE)；使用來(lái)自用作初級(jí)引物的寡核苷酸(其能夠與該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合)的分離物和與該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA不互補(bǔ)的通用引物對(duì)該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增；并且通過(guò)探針檢測(cè)是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物。

背景技術(shù)

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組DNA中，除了A、C、G和T外還有第五個(gè)堿基，即5-甲基胞嘧啶，其中一個(gè)甲基基團(tuán)與胞嘧啶環(huán)的第五個(gè)碳附接(5-mC)。5-mC總是僅與CG二核苷酸(5’-mCG-3’)的C附接，該CG二核苷酸通常被標(biāo)記為CpG。CpG的C大多通過(guò)與甲基附接而甲基化。該CpG的甲基化抑制了基因組中的重復(fù)序列(如Alu或轉(zhuǎn)座子)的表達(dá)。此外，該CpG是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常出現(xiàn)表觀遺傳變化的位點(diǎn)。該CpG的5-mC天然脫氨至T，并且因此，哺乳動(dòng)物基因組中的CpG顯示的頻率僅為1％，遠(yuǎn)低于正常頻率(1/4x1/4＝6.25％)。

CpG異常整合的區(qū)域稱為CpG島。術(shù)語(yǔ)“CpG島”是指長(zhǎng)度為0.2-3kb并且C+G含量大于50％并且CpG比例大于3.75％的位點(diǎn)。人類基因組中有約45,000個(gè)CpG島，并且主要在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)它們。實(shí)際上，CpG島出現(xiàn)在占人類基因約50％的管家基因的啟動(dòng)子中。已知異常DNA甲基化主要發(fā)生在基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)，以減少基因的表達(dá)。

在本文中，基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)包括啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)和＝5’非翻譯區(qū)。最近，有人積極地進(jìn)行了檢查血液、痰、唾液、糞便或尿液中腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化并將檢查結(jié)果用于各種癌癥的診斷和治療的嘗試。

眾所周知，DNA通過(guò)包括細(xì)胞凋亡和壞死的過(guò)程從癌癥患者的癌組織中的異常細(xì)胞釋放到血液中，并且因此在血液的血清或血漿中以無(wú)細(xì)胞腫瘤DNA的形式存在，并且甲基化的DNA片段也存在于無(wú)細(xì)胞腫瘤DNA中。這種異常DNA甲基化的存在已被用作診斷癌癥的一種標(biāo)志物。

同時(shí)，一般來(lái)說(shuō)，用于分析基因甲基化的方法是通過(guò)檢測(cè)不參與甲基化的對(duì)照基因、通過(guò)PCR以證實(shí)PCR的適合性和輸入DNA的存在與否、以及與其平行進(jìn)行PCR以檢測(cè)靶標(biāo)DNA的甲基化。

具體而言，作為通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)分析甲基化的方法，可以考慮以下方法：i)使用靶標(biāo)DNA甲基化非依賴性引物作為實(shí)時(shí)PCR的引物并使用能夠與甲基化靶標(biāo)DNA雜交的甲基化特異性檢測(cè)引物以檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法；ii)使用靶標(biāo)DNA甲基化特異性引物作為實(shí)時(shí)PCR引物并使用能夠與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的甲基化非依賴性序列雜交的檢測(cè)探針的方法；并且iii)使用靶標(biāo)DNA甲基化特異性引物作為實(shí)時(shí)PCR引物并使用能夠與甲基化靶標(biāo)DNA雜交的甲基化特異性檢測(cè)探針以檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。

然而，這些方法都直接使用未富集的DNA作為模板，并且必須同時(shí)使用兩種引物(正向和反向)來(lái)擴(kuò)增靶標(biāo)DNA。因此，每當(dāng)待在一個(gè)試管(單個(gè)反應(yīng)器)中擴(kuò)增的靶標(biāo)增加時(shí)，存在進(jìn)一步需要兩種引物的問(wèn)題。