[發(fā)明專利]用于多重檢測(cè)甲基化DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780069147.8
• 申請(qǐng)日: 2017-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN109952381B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 安城皖;吳泰禎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 基因特力株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 陳桉

1.組合物在制備用于檢測(cè)甲基化DNA的試劑盒中的用途，所述組合物包括：

至少一種處理含靶標(biāo)DNA的樣品的試劑，該試劑修飾非甲基化DNA位點(diǎn)以使其區(qū)分于甲基化DNA位點(diǎn)；

反向引物，其包含能夠與用該試劑處理的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)結(jié)合的靶特異性序列和不與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物，該通用引物融合至所述靶特異性序列的5’端，該試劑修飾非甲基化DNA位點(diǎn)以使其區(qū)分于甲基化DNA位點(diǎn)；

正向引物，其能夠與線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合，和通用引物，其不與該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合；和

探針，其能夠與該線性擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)雜交，

其中該甲基化DNA是通過(guò)以下進(jìn)行檢測(cè)的：

(a) 用至少一種修飾非甲基化DNA位點(diǎn)以使其區(qū)分于甲基化DNA位點(diǎn)的試劑處理含靶標(biāo)DNA的樣品；

(b) 構(gòu)建反向引物，其包含被設(shè)計(jì)為能夠與用該試劑處理的靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的靶標(biāo)特異性序列和不與該靶標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合的通用引物，該通用引物與該靶特異性序列的5’端結(jié)合；

(c) 使用步驟 (a) 中用該試劑處理的靶標(biāo)DNA作為模板，并使用步驟(b) 中構(gòu)建的該反向引物作為引物，通過(guò)單向PCR進(jìn)行單向非對(duì)稱線性擴(kuò)增；

(d) 使用一種能夠與步驟 (c) 中線性擴(kuò)增的DNA互補(bǔ)結(jié)合的正向引物和一種通用引物來(lái)擴(kuò)增該靶標(biāo)DNA；并且

(e) 通過(guò)能夠與步驟 (d) 中擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)雜交的探針檢測(cè)該靶標(biāo)DNA的甲基化。

2.權(quán)利要求1的用途，其中該試劑為重亞硫酸鹽。

3.權(quán)利要求1的用途，其中通過(guò)用該試劑處理，將至少一個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶或與胞嘧啶不同的另一種堿基。

4.權(quán)利要求1的用途，其中檢測(cè)單個(gè)反應(yīng)器中樣品中的多個(gè)靶標(biāo)DNA甲基化。

5.權(quán)利要求1的用途，其中該步驟 (b) 或 (d) 的該通用引物包含選自由SEQ ID NO:7和35至41表示的核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)序列。

6.權(quán)利要求1的用途，其中步驟 (b) 的該靶標(biāo)特異性序列與該靶標(biāo)DNA的甲基化位點(diǎn)和/或非甲基化位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合。

7.權(quán)利要求1的用途，其中步驟 (b) 的該靶標(biāo)特異性序列包含一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸。

8.權(quán)利要求1的用途，其中步驟 (b) 的該靶標(biāo)特異性序列包含選自由SEQ ID NO: 2、5、9、14、17、21和26表示的序列的一個(gè)或多個(gè)序列。

9.權(quán)利要求1的用途，其中甲基化的檢測(cè)是通過(guò)選自以下的任一種方法進(jìn)行：PCR、DNA芯片分析和測(cè)序。

10.權(quán)利要求9的用途，其中甲基化的檢測(cè)是通過(guò)甲基化特異性PCR、使用甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白的PCR、定量PCR、合成測(cè)序或連接測(cè)序進(jìn)行的。

11.權(quán)利要求10的用途，其中甲基化的檢測(cè)是通過(guò)實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR或使用甲基化DNA特異性結(jié)合抗體的PCR進(jìn)行的。

12.權(quán)利要求1的用途，其中步驟 (d) 的該正向引物包含一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸。

13.權(quán)利要求1的用途，其中步驟 (d) 的該正向引物包含選自由SEQ ID NO: 1、4、8、10至13、15、16、18至20、22至25、27和28表示的序列的一個(gè)或多個(gè)序列。

14.權(quán)利要求1的用途，其中步驟 (e) 的該探針包含一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸。

15.權(quán)利要求1的用途，其中步驟 (e) 的該探針包含選自由SEQ ID NO: 3、6、29、30和31至34表示的序列的一個(gè)或多個(gè)序列。