[發明專利]用于調準激光掃描熒光顯微鏡的方法和具有自動調準設備的激光掃描熒光顯微鏡

有效

• 申請號: 201780068291.X
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN109923459B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: J·海涅;M·羅伊斯;B·哈爾克;L·卡斯特魯普
• 申請（專利權）人: 阿貝里奧儀器有限責任公司
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G01N21/63;G01N21/64
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 郭毅

為了調節激光掃描熒光顯微鏡(15)的正確調準，在所述正確調準中激勵光(6)的最大強度(1)和熒光阻止光(7)的最小強度(4)和/或布置在熒光探測器(18)前的光闌(2)的成像在鏡頭(20)的焦點中重合，以所述激勵光(6)的最大強度(1)掃描樣品(22)中的以熒光著色劑標記的結構，以便產生所述樣品(22)的圖像(A、B)，所述圖像具有所述結構的影像(3，30，31，32)，并且由在所述圖像中所述結構的所述影像(3，30，31，32)計算和補償在所產生的圖像中所述結構的成像的位置之間的錯位(8)。在此，所產生的圖像相應于所述熒光阻止光(7)的不同強度和/或所述光闌(2)的不同光闌開口。

技術領域

本發明涉及一種用于調節激光掃描熒光顯微鏡的正確調準的方法，在所述正確調準中激勵光的最大強度和熒光阻止光的最小強度和/或布置在熒光探測器前的光闌的成像(Abbildung)在鏡頭的焦點中重合。本發明尤其涉及一種以下方法：該方法為了調節調準使用以下度量(Metrik)，計算該度量并且該度量能夠實現精確的自動調準。

此外，本發明涉及一種激光掃描熒光顯微鏡，其具有用于實施這種方法的自動調準設備。

激光掃描熒光顯微鏡尤其是具有布置在熒光探測器前的光闌的共焦的顯微鏡和/或高分辨率的激光掃描熒光顯微鏡，在所述高分辨率的激光掃描熒光顯微鏡的情況下通過具有最小強度的熒光阻止光提高分辨率。熒光阻止光尤其可以是所謂的STED光或轉換光，該STED光或該轉換光通過受激地發射或通過轉化到黑暗狀態中阻止熒光著色劑發射熒光。

背景技術

由T.J.Gould等人的《Auto-aligning stimulated emission depletionmicroscope using adaptive optics》(光學快報，第38卷，第11號(2013)1860-1862)和US2015/0226950 A1已知一種用于調準STED激光掃描熒光顯微鏡的傳統的方法和一種用于調準STED激光掃描熒光顯微鏡的使用度量的方法，以便將經聚焦的STED光的最小強度對準經聚焦的激勵光的中心。在傳統的方法的情況下，對金顆粒的散射光進行成像，并且使STED光的和激勵光的焦點的位置相對彼此地移位，直至其點分布函數彼此取向。傳統的方法需要將STED激光掃描熒光顯微鏡切換到散射光成像模式中，并且通常基于手動地調節STED光的和激勵光的焦點的位置。在使用度量的已知的方法的情況下，對于STED光的和激勵光的焦點的不同相對位置由STED圖像的亮度和清晰度計算出度量，并且根據以下情況確定最佳的相對位置：度量取最大值。隨后可以緊接著細調準，在該細調準的情況下使用第二度量，在第二度量中僅涉及STED圖像的亮度。第二度量基于以下：如果STED光的最小強度的位置對準激勵光的最大強度的中心，那么STED圖像最亮。為了證明使用度量的已知的方法的功能，在使用度量的調準前或在使用度量的調準后比較以相同的激光掃描熒光顯微鏡記錄的共焦圖像和STED圖像。在還未經調準的顯微鏡的情況下，在STED圖像和共焦圖像中發熒光的顆粒的圖像的重心彼此偏差，而在經調準的激光掃描熒光顯微鏡的圖像中的重心除了4.3+/-2.3nm的錯位以外重合。對于這個值應注意的是，該值遠遠低于在大多的STED顯微鏡的典型的局部分辨率并且該值未示出優先方向。為了使STED光的和激勵光的焦點相對移位，提出在STED光的射束路徑中使用空間光調制器(SLM)。

由文獻DE 10 2007 011 305 A1已知用于在具有至少兩個彼此獨立的光源的光學射束路徑中進行射束調準的一種設備和一種方法。在此，尤其涉及高分辨率的STED激光掃描熒光顯微鏡的射束路徑。光源的射束在共同的照射射束路徑中疊加。暫時將校準標本——根據該校準標本可以檢查射束的瞳孔位置和/或焦點位置——引入到照射射束路徑中。具體地，可以在照射射束路徑中在中間圖像的位置處或在中間圖像的附近引入校準標本，并且該校準標本具有表面結構。為了調準目的，設有至少一個調節元件以影響要合并的射束中的至少一個射束的瞳孔位置和/或焦點位置。已知的借助校準標本的射束調準不考慮以下光學元件的影響：所述光學元件在照射射束路徑中處于校準標本的后面。換句話說，校準標本僅僅允許在中間圖像的范圍內進行調準，但是不允許在樣品中在鏡頭的焦點的范圍內進行調準。