[發明專利]宏基因組樣品中病原體的鑒定和抗生素表征

有效

• 申請號: 201780063630.5
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN109923217B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: P·馬埃;M·圖爾努德;S·斯奇克林;G·貴貢;E·魯佩
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;G16B40/00;G16B30/00
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 區斌

鑒定宏基因組樣品中包含的病原體和鑒定所述病原體基因組中的病原性標志物的方法，該方法包括以下步驟：?處理(12)宏基因組樣品以從病原體中提取DNA，?測序(14)提取的DNA，從而產生讀長組，?將所述讀長組與已知病原體基因組的數據庫進行比較(22)，以便將讀長分配給所述已知病原體；?產生(26)讀長池，其包含分配給病原體的讀長，以及組裝(28)匯集的讀長以產生重疊群，?將重疊群與遺傳標志物的第二數據庫進行比較(30)，以檢查產生的重疊群是否含有標志物，該方法還包括以下步驟：?將所述讀長組與第二數據庫進行比較(24)以便將讀長分配給標志物，如果它完全落入所述標志物中或者如果它是跨越所述標志物則將讀長分配給標志物，并且所述池中還包含分配給所述標志物的讀長，因此，所述重疊群由分配給病原體的讀長和分配給標志物的讀長組裝而成。

技術領域

本發明涉及宏基因組學領域，且特別是通過斷言在其基因組中存在抗生素抗性標志物來表征宏基因組樣品中病原體的抗生素敏感性。

背景技術

目前，臨床樣品中病原體通過經典微生物學技術的鑒定和抗生素敏感性測試(AST)概況需要大量測試和/或許多關于病原體的先驗知識。例如，微生物學工作流程涉及病原體的生長(例如在陪替氏培養皿上)以分離它們并獲得后續測試所需的關鍵生物量。然而，不同的細菌可能需要不同的培養條件(例如好氧細菌與厭氧細菌)，如果不以適當的方式選擇培養條件，則可在培養期間競爭，或甚至可能根本不生長。因此，培養基的選擇通常基于關于樣品中病原體的假設。此外，測試需要預先鑒定病原體(例如革蘭氏陽性或陰性)以選擇AST的試劑。因此，微生物技術的穩健性有時可能是有問題的。

此外，經典微生物學需要24小時至48小時才能獲得病原體的鑒定和抗生素敏感性測試(AST)概況，甚至需要數周來使細菌(如分枝桿菌)緩慢生長。在這段時間內，臨床醫生不知道哪種病原體感染患者，并因此不能提供任何特定的治療。不僅患者的生命可能受到威脅，而且還迫使臨床醫生在獲得AST概況并調整他的治療之前給予患者廣譜抗生素，這是細菌隨時間發展抗生素抗性機制的主要原因之一。

在微生物學中，宏基因組學是基于核酸(NA)測序的技術，其旨在使用線性工作流程來表征樣品的微生物含量，其中關于該含量的先驗信息較少。特別是，宏基因組學不涉及細菌的生長以分離它們，并且宏基因組工作流程中步驟的選擇不依賴于前述步驟的結果。此外，工作流程持續時間基本上與樣品中包含的微生物無關，并且可以處理包含不同微生物(例如不同細菌物種)的混合物的樣品，并同時獲得樣品的微生物含量的全貌。

最近設計了快速且穩健的測序技術，特別是高通量測序(HTS)(例如全基因組測序(WGS)、下一代測序(NGS))，其可以精確和快速地測序大基因組。基于這些技術，HTS宏基因組工作流程包括：

a.從患者或動物(例如支氣管肺泡灌洗液、血液、尿液、唾液、糞便......)收集的樣品(例如組織或體液樣品)、食物樣品或環境樣品(例如空氣、水)；

b.從樣品中的細胞中提取核酸(例如基因組DNA)；

c.將核酸分子隨機剪切成較小的片段并標記片段以進行擴增和測序；

d.至少對于第二代HTS，擴增片段(例如通過基于PCR的技術)以獲得每個片段的多個拷貝，從而允許從測序步驟獲得可讀信號；

e.對片段進行測序，從而產生一組數字的核酸序列(通常稱為“原始讀長”或“讀長”)；

f.使用計算機處理工作流程(通常稱為“生物信息學流程”或“流程”)分析讀長以表征樣品的內容物(例如，鑒定樣品中的微生物)。

基本上，有兩種類型的流程用于表征樣品內容物，第一種類型的流程使用分類學聚類(taxonomic?binning)，第二種類型使用分析(profiling)。