[發(fā)明專利]從核酸測序制備物除去銜接子二聚體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201780060758.6
• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN109790577A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: R.W.戴維斯;A.比比羅
• 申請（專利權(quán)）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 石克虎;黃希貴

提供了制備用于測序的多核苷酸的測序銜接子和方法。所述測序銜接子包含甲基依賴性內(nèi)切核酸酶的識別序列的一部分。在銜接子與靶多核苷酸連接期間形成的不需要的銜接子二聚體產(chǎn)生完整的限制序列并被內(nèi)切核酸酶切割，然后進(jìn)行外切核酸酶消化，從而除去所述二聚體。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于從核酸測序樣品制備混合物除去不需要的銜接子二聚體的方法和組合物。

背景

大多數(shù)DNA測序技術(shù)依賴于特異性DNA銜接子與樣品DNA片段末端的連接，以創(chuàng)建聚合酶引物位點(diǎn)、添加樣品捕獲位點(diǎn)、將樣品“條碼化”，以及向樣品添加校準(zhǔn)位點(diǎn)，以及許多可能的用途。將銜接子核酸連接至待測序的DNA樣品的每個(gè)末端。銜接子連接的DNA片段的創(chuàng)建通常包括相互連接的銜接子，形成不需要的“銜接子二聚體”。

目前，通過小片段清除步驟除去銜接子二聚體，例如使用磁珠捕獲大的多核苷酸片段并與小片段分離。這種方法不是基于序列的，并且因此是非特異性和低效的。如果樣品是環(huán)化的，則可以通過用外切核酸酶處理使非環(huán)化的銜接子從其暴露的末端解聚。特別地，從一組近似或相似大小的DNA樣品片段中去除環(huán)化的銜接子二聚體是特別困難的。清除步驟沒有基于尺寸有效地除去二聚體或花費(fèi)相當(dāng)長的時(shí)間。此外，環(huán)狀銜接子不能被外切核酸酶解聚，因?yàn)樗鼈儧]有暴露的末端。

需要更有效和特異的方法來除去不需要的銜接子二聚體。

發(fā)明內(nèi)容

提供了用于多核苷酸測序的銜接子以及將其用于測序方法的方法和試劑盒。本文所述的銜接子和方法可用于產(chǎn)生用于測序的多核苷酸樣品，其沒有銜接子二聚體或具有極低水平的銜接子二聚體，否則所述銜接子二聚體會干擾多核苷酸測序方法或降低多核苷酸測序方法的效率。

一方面，提供了制備用于測序的靶DNA雙鏈體的方法。在本文公開的方法中，銜接子包含甲基依賴性內(nèi)切核酸酶識別序列的一部分，當(dāng)其在銜接子二聚體中共價(jià)連接時(shí)，將形成完整的識別序列并將被內(nèi)切核酸酶消化。通過甲基依賴性內(nèi)切核酸酶消化，然后通過外切核酸酶消化，來除去銜接子二聚體。與用于測序的靶多核苷酸連接的銜接子對內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶的消化不敏感，并且因此僅從樣品中除去不需要的銜接子二聚體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)將多個(gè)測序銜接子的雙鏈多核苷酸雙鏈體區(qū)共價(jià)連接至多個(gè)平端靶DNA雙鏈體的第一和第二末端，從而產(chǎn)生多個(gè)銜接子連接的靶DNA雙鏈體，其具有共價(jià)連接在靶DNA雙鏈體的每個(gè)末端的測序銜接子，其中每個(gè)銜接子的雙鏈多核苷酸雙鏈體區(qū)在其末端包含甲基依賴性內(nèi)切核酸酶的識別序列的一部分，其中如果兩個(gè)銜接子的雙鏈體區(qū)共價(jià)連接在一起產(chǎn)生銜接子二聚體，則將形成甲基依賴性內(nèi)切核酸酶的完整識別序列；(b)如果有任何銜接子二聚體，通過用甲基依賴性內(nèi)切核酸酶消化，然后用一種或多種外切核酸酶消化，來除去所述銜接子二聚體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括：(a)提供多個(gè)測序銜接子，其中每個(gè)所述銜接子包含雙鏈多核苷酸雙鏈體區(qū)，其中所述雙鏈多核苷酸雙鏈體區(qū)在其末端包含甲基依賴性內(nèi)切核酸酶的識別序列的一部分，其中如果兩個(gè)銜接子的雙鏈體區(qū)共價(jià)連接在一起產(chǎn)生銜接子二聚體，則將形成甲基依賴性內(nèi)切核酸酶的完整識別序列；(b)將所述測序銜接子的雙鏈體區(qū)共價(jià)連接至多個(gè)平端靶DNA雙鏈體的第一和第二末端，從而產(chǎn)生多個(gè)銜接子連接的靶DNA雙鏈體，其具有共價(jià)連接在靶DNA雙鏈體的每個(gè)末端的測序銜接子；(c)如果有任何銜接子二聚體，通過用甲基依賴性內(nèi)切核酸酶消化，然后用一種或多種外切核酸酶消化，來除去所述銜接子二聚體。

銜接子可以包含單鏈發(fā)夾區(qū)或可以是線性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)所述銜接子包含單鏈多核苷酸發(fā)夾區(qū)和雙鏈多核苷酸雙鏈體區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)銜接子是包含第一和第二多核苷酸鏈的線性多核苷酸，其中每個(gè)銜接子包含雙鏈多核苷酸雙鏈體區(qū)和3'突出端區(qū)，其中第一鏈包含3'突出端區(qū)并在3'末端或在3'末端附近包含對外切核酸酶消化具有抗性的修飾核苷酸(例如，硫代核苷酸)，并且作為多核苷酸雙鏈體的一部分的第二鏈在5'末端或5'末端附近包含對外切核酸酶消化具有抗性的修飾核苷酸(例如，硫代核苷酸)。