[發明專利]從核酸測序制備物除去銜接子二聚體的方法

在審

• 申請號: 201780060758.6
• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN109790577A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: R.W.戴維斯;A.比比羅
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 石克虎;黃希貴

1.一種制備用于測序的靶DNA雙鏈體的方法，所述方法包括：

(a) 提供多個測序銜接子，其中每個所述銜接子包含雙鏈多核苷酸雙鏈體區，其中所述雙鏈多核苷酸雙鏈體區在其末端包含甲基依賴性內切核酸酶的識別序列的一部分，其中如果兩個銜接子的雙鏈體區共價連接在一起產生銜接子二聚體，則將形成所述甲基依賴性內切核酸酶的完整識別序列；

(b) 將所述測序銜接子的雙鏈體區共價連接到多個平端靶DNA雙鏈體的第一和第二末端，從而產生多個銜接子連接的靶DNA雙鏈體，其具有共價連接在所述靶DNA雙鏈體的每個末端的測序銜接子；和

(c) 如果有任何銜接子二聚體，通過用甲基依賴性內切核酸酶消化，然后用一種或多種外切核酸酶消化，來除去所述銜接子二聚體。

2.根據權利要求1的方法，其中每個所述銜接子包含單鏈多核苷酸發夾區和雙鏈多核苷酸雙鏈體區。

3.根據權利要求1的方法，其中每個所述銜接子是包含第一和第二多核苷酸鏈的線性多核苷酸，其中每個銜接子包含含有雙鏈多核苷酸雙鏈體區的第一末端和含有第一鏈的3'末端和第二鏈的5'末端的第二末端，其中第一鏈包含單鏈3'突出端區，其包含位于3'末端或3'末端附近的硫代核苷酸，且第二鏈包含位于5'末端或5'末端附近的硫代核苷酸。

4.根據權利要求1的方法，其中每個所述銜接子中的雙鏈多核苷酸雙鏈體區包含含有5'末端的第一鏈，其雜交至含有3'末端的第二鏈，其中所述第一鏈包含位于5'末端的序列GG，其雜交至位于所述第二鏈3'末端的序列CC_Me。

5.根據權利要求1的方法，其中每個所述銜接子中的雙鏈多核苷酸雙鏈體區包含含有5'末端的第一鏈，其雜交至含有3'末端的第二鏈，其中所述第一鏈包含位于5'末端的序列TC，其雜交至位于3'末端的序列GA_Me。

6.根據權利要求1的方法，其中步驟(b)包括使用連接酶進行共價連接。

7.根據權利要求1的方法，其中所述靶DNA包含用未甲基化核苷酸合成的基因組DNA片段的拷貝。

8.一種制備用于測序的多核苷酸樣品的方法，包括將測序銜接子共價連接到待測序的靶DNA雙鏈體，其中用于測序的多核苷酸樣品根據權利要求1的方法制備，并包含少于約1％的銜接子二聚體。

9.一種測序多核苷酸的方法，包括根據權利要求2制備用于測序的靶DNA雙鏈體，

其中每個銜接子的單鏈發夾區包含引物結合序列，且

其中所述方法進一步包括：

(d) 使引物與引物結合序列雜交并用DNA聚合酶延伸所述引物，從而制備用于測序的引物延伸產物。

10.一種測序多核苷酸的方法，包括根據權利要求3制備用于測序的靶DNA雙鏈體，

其中所述單鏈3'突出端區包含引物結合序列，并且其中所述方法還包括：

(d) 使引物與引物結合序列雜交并用DNA聚合酶延伸所述引物，從而制備用于測序的引物延伸產物。

11.用于多核苷酸測序的銜接子，其包含雙鏈多核苷酸雙鏈體區，其中所述雙鏈多核苷酸雙鏈體區在其末端包含甲基依賴性內切核酸酶的識別序列的一部分，其中如果兩個銜接子的雙鏈體區共價連接在一起產生銜接子二聚體，則將形成所述甲基依賴性內切核酸酶的完整識別序列。

12.一種測序多核苷酸的方法，其包括測序包含多個銜接子連接的DNA雙鏈體的多核苷酸樣品，所述銜接子連接的DNA雙鏈體具有共價連接在靶DNA雙鏈體的每個末端的根據權利要求11的測序銜接子，其中所述多核苷酸樣品包含少于約1％的銜接子二聚體。