[發(fā)明專(zhuān)利]蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780060705.4
• 申請(qǐng)日: 2017-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109843790A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖加利;C·貝利斯勒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 生物輻射實(shí)驗(yàn)室股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): B82Y15/00
• 分類(lèi)號(hào): B82Y15/00;C07K1/34;C07K16/00;G01N33/53
• 代理公司: 上海專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳揚(yáng)揚(yáng);陶啟長(zhǎng)

提供了純化蛋白質(zhì)?納米顆粒偶聯(lián)物的方法和試劑盒。在一些實(shí)施方式中，使用具有尺寸排阻模式和捕獲模式的多模式介質(zhì)來(lái)純化蛋白質(zhì)?納米顆粒偶聯(lián)物。

本申請(qǐng)要求2016年9月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/401,573的權(quán)益，該申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。

背景

當(dāng)與蛋白質(zhì)偶聯(lián)時(shí)，納米顆粒(例如，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?012/0282632中所述的聚合物點(diǎn)和量子點(diǎn))是有用的報(bào)告分子。蛋白質(zhì)和納米顆粒之間的偶聯(lián)反應(yīng)通常使用摩爾過(guò)量的蛋白質(zhì)進(jìn)行，以確保最佳的偶聯(lián)比率。偶聯(lián)后，需要將偶聯(lián)物與剩余的游離蛋白質(zhì)分離，因?yàn)槲磁悸?lián)的蛋白質(zhì)可能會(huì)干擾例如使用偶聯(lián)物的測(cè)定。尺寸排阻色譜(SEC)和離心已用于將偶聯(lián)物與過(guò)量的游離蛋白質(zhì)分離。SEC需要使用昂貴的尺寸排阻樹(shù)脂填充大柱。離心僅可應(yīng)用于與其中懸浮納米顆粒的介質(zhì)相比相對(duì)致密的納米顆粒。離心后，納米顆粒偶聯(lián)物也可形成可能不易分散的團(tuán)塊。

發(fā)明內(nèi)容

提供了純化蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括使蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物，游離蛋白質(zhì)和緩沖劑的混合物與多模式(multimodal)介質(zhì)接觸以將蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物與游離蛋白質(zhì)分離，其中多模式介質(zhì)具有尺寸排阻模式和捕獲模式；并且從介質(zhì)中收集蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物，從而純化蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物。

在一些實(shí)施方式中，多模式介質(zhì)包含多糖并且具有包埋在其中的羥基磷灰石微晶。在一些實(shí)施方式中，多模式介質(zhì)包含多糖并且具有用疏水且?guī)д姾傻呐潴w官能化的芯。在某些實(shí)施方式中，配體中的一個(gè)或多個(gè)是辛胺。在一些實(shí)施方式中，介質(zhì)還包含基于多糖的外殼。在某些實(shí)施方式中，多糖是瓊脂糖。在一些實(shí)施方式中，外殼包含瓊脂糖。

在一些實(shí)施方式中，多模式介質(zhì)包含丙烯酰胺。

在一些實(shí)施方式中，納米顆粒是聚合物點(diǎn)(p-dot)。在一些實(shí)施方式中，p-dot的直徑為5-100nm并且是膠體半導(dǎo)體聚合物。在一些實(shí)施方式中，p-dot是熒光的。

在一些實(shí)施方式中，混合物還包含游離納米顆粒，并且介質(zhì)將游離納米顆粒與偶聯(lián)物分離。

在某些實(shí)施方式中，混合物包含表面活性劑。在一些實(shí)施方式中，表面活性劑是Pluronic F68和/或聚亞烷基二醇。在一些實(shí)施方式中，混合物中的表面活性劑濃度為0.02％-1.0％。

在某些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)是抗體。在一些實(shí)施方式中，該抗體是IgG抗體。

在一些實(shí)施方式中，收集步驟包括從介質(zhì)中收集富含蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分。在某些實(shí)施方式中，收集步驟包括向介質(zhì)施加離心力或真空，并從介質(zhì)中收集富含蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分。

在一個(gè)實(shí)施方式中，用于從游離蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物的試劑盒包括柱(例如旋轉(zhuǎn)柱)和具有尺寸排阻模式和捕獲模式的多模式介質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含至少一種由以下組成的組分：納米顆粒，緩沖劑，表面活性劑，偶聯(lián)劑，以及用于實(shí)施從游離蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物的方法的說(shuō)明書(shū)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新的色譜介質(zhì)和條件的組合，其允許從游離蛋白質(zhì)(例如，游離抗體)中分離蛋白質(zhì)-納米顆粒偶聯(lián)物(例如，抗體-聚合物點(diǎn)偶聯(lián)物)。

I.定義

術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白或其片段形式。該術(shù)語(yǔ)包括但不限于：源自人或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM型的多克隆或單克隆抗體，包括天然形式或遺傳修飾形式，如人源化、人、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變、移接和體外生成的抗體。“抗體”包括復(fù)合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗體”也包括抗體片段，如Fab、F(ab′)₂、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它組合形式，無(wú)論它們是否保留抗原結(jié)合功能。