[發明專利]設計者α1;6-巖藻糖苷酶突變體實現完整N-糖肽和N-糖蛋白的直接核心巖藻糖基化

在審

• 申請號: 201780056946.1
• 申請日: 2017-08-10
• 公開（公告）號: CN109715819A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 王來曦;李超;朱世雷
• 申請（專利權）人: 馬里蘭大學帕克分校
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12N9/24
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 金海霞;楊青

本發明提供新的巖藻糖苷酶突變體，其作為巖藻糖?連接酶起作用，用于包括完整的治療性抗體在內的多種生物學糖肽和糖蛋白的核心巖藻糖基化。在干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)α1,6?巖藻糖苷酶的廣義酸/堿殘基E274處具有突變的幾種突變體，包括E274A、E274S、和E274G，能夠有效地使多種復雜的N?糖肽和完整糖蛋白巖藻糖基化。所述位點特異性突變體能夠將巖藻糖轉移至核心GlcNAc?Asn殘基并可用于藥物遞送和疫苗開發。

本發明中的政府權益

本發明是在美國國家衛生研究所以資助號R01GM080374D授予的政府支持下做出的。美國政府在本發明中享有某些權益。

相關申請的交叉引用

本申請要求2016年8月10日提交的共同待決美國臨時申請號62/373151的優先權，所述申請的內容由此通過引用并入本文中，用于所有目的。

發明背景

技術領域

本發明提供新的巖藻糖苷酶突變體，其作為用于包括完整的治療性抗體在內的多種生物學糖肽和糖蛋白的核心巖藻糖基化的巖藻糖-連接酶起作用。位點特異性突變體能夠將巖藻糖轉移至核心GlcNAc-Asn殘基并可用于藥物遞送和疫苗開發。

相關技術

天冬酰胺-連接的糖基化作用，即N-糖基化，是哺乳動物中最普遍的蛋白質翻譯后修飾之一，其在調節基礎蛋白質的固有性質和生物學功能中起到重要的作用^1,2。例如，連接的N-聚糖可以對蛋白質的折疊、穩定性、抗原性和免疫原性產生深刻的影響^2,3。另一方面，N-聚糖可以直接參與各種生物學識別過程，包括細胞粘著、宿主-病原體相互作用、癌癥轉移和免疫應答^1,4-9。盡管所有哺乳動物N-聚糖共享共同的低聚糖核心結構，但是該核心的進一步裝飾，例如唾液酸化和巖藻糖基化，在調節生物學功能方面增加了另一水平的結構多樣性。

N-聚糖中的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分是一種重要的N-糖蛋白修飾。已有令人信服的數據表明糖蛋白的核心-巖藻糖基化調節各種細胞功能。例如，許多研究已經揭示了增加的核心巖藻糖基化經常與癌癥進展有關^10-12。AFP-L3，作為核心-巖藻糖基化的甲胎蛋白，已經被管理機構批準作為肝細胞癌——肝癌的主要形式的生物標志物¹³。已經通過實驗證明了核心-巖藻糖基化在發育中的作用—在小鼠模型中敲除FUT8基因誘導了出生后發育過程中嚴重的生長停滯和死亡¹⁴。核心巖藻糖基化還直接調節糖蛋白的生物學活性，例如治療性單克隆抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)¹⁵，生長因子受體和粘著分子的信號傳導功能^14,16-20和IgG B細胞受體的抗原識別²¹。另一方面，結構研究提示，核心-巖藻糖基化可以顯著地影響N-聚糖的構象^22,23。