[發(fā)明專利]設(shè)計(jì)者α1;6-巖藻糖苷酶突變體實(shí)現(xiàn)完整N-糖肽和N-糖蛋白的直接核心巖藻糖基化

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201780056946.1
• 申請(qǐng)日: 2017-08-10
• 公開（公告）號(hào): CN109715819A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王來曦;李超;朱世雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 馬里蘭大學(xué)帕克分校
• 主分類號(hào): C12P21/00
• 分類號(hào): C12P21/00;C12N9/24
• 代理公司: 中原信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11219
• 代理人: 金海霞;楊青

1.用于將N-糖肽或N-糖蛋白巖藻糖基化的催化方法，所述方法包括：

提供含GlcNAc的肽、蛋白質(zhì)或其它聚糖作為GlcNAc受體(受體底物)；

提供用于接近巖藻糖的活化的糖基供體；和

提供α1,6-巖藻糖苷酶突變體酶，用于利用巖藻糖將GlcNAc受體酶促轉(zhuǎn)巖藻糖基化，其中所述α1,6-巖藻糖苷酶突變體酶是干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)α-巖藻糖苷酶突變體，由此合成巖藻糖基化的糖肽或糖蛋白。

2.權(quán)利要求1的催化方法，其中所述活化的糖基供體選自α-巖藻糖基氟化物αFucF、α-巖藻糖基氯化物、α-巖藻糖基疊氮化物、4-硝基苯基α-巖藻糖苷、3-硝基苯基α-巖藻糖苷、3,4-二硝基苯基α-巖藻糖苷和4-甲基傘形基α-巖藻糖苷。

3.權(quán)利要求1的催化方法，其中α1,6-巖藻糖苷酶突變體酶選自E274A、E274S、E274G、E274T、E274C、E274I、E274L、E274M、E274F、E274W、E274Y和E274V，或其具有至少90％同源性的突變體，它們具有巖藻糖基化活性且衍生自干酪乳桿菌巖藻糖苷酶(AlfC)。

4.權(quán)利要求1的催化方法，其中α1,6-巖藻糖苷酶突變體酶選自衍生自干酪乳桿菌α-巖藻糖苷酶(SEQ ID NO:4)的E274A(SEQ ID NO:1)、E274S(SEQ ID NO:2)和E274G(SEQ IDNO:3)。

5.權(quán)利要求4的催化方法，其還包括CPD和HIS(SEQ ID NO:31)或CPD(SEQ ID NO.30)。

6.用于制備均質(zhì)的巖藻糖基化糖肽或糖蛋白的化學(xué)酶促方法，所述方法包括：

提供非巖藻糖基化的糖肽或糖蛋白受體；和

使所述非巖藻糖基化的糖肽或糖蛋白受體與包括活化的含巖藻糖部分的供體底物在干酪乳桿菌α1,6-巖藻糖苷酶E274突變體蛋白質(zhì)或其片段的存在下反應(yīng)，所述突變體蛋白質(zhì)或其片段包括催化結(jié)構(gòu)域并相對(duì)于野生型α1,6-巖藻糖苷酶E274酶表現(xiàn)出增加的轉(zhuǎn)巖藻糖基化和降低的水解活性，以將所述活化的含巖藻糖部分轉(zhuǎn)移至所述非巖藻糖基化的糖肽或糖蛋白受體并得到均質(zhì)的巖藻糖基化糖肽或糖蛋白。

7.權(quán)利要求6的化學(xué)酶促方法，所述均質(zhì)的糖肽和糖蛋白包括與肽或蛋白質(zhì)連接的聚糖，所述聚糖選自高甘露糖型、唾液酸化和去唾液酸復(fù)合型、混合型和它們的類似物。

8.權(quán)利要求6的化學(xué)酶促方法，其中所述非巖藻糖基化的糖肽或糖蛋白受體可以包括一個(gè)或多個(gè)Asn(天冬酰胺)-連接的GlcNAc部分或多個(gè)N-聚糖位點(diǎn)，從而允許引入一個(gè)或多個(gè)核心巖藻糖。

9.權(quán)利要求6的化學(xué)酶促方法，其中所述糖蛋白或糖蛋白選自抗體組，所述抗體組包括17b、48d、A32、C11、2G12、F240、IgG1b12、19e、X5、TNX-355、西妥昔單抗、利妥西單抗、莫羅單抗-CD3、阿昔單抗、達(dá)利珠單抗、巴利西單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥單抗奧唑米星、阿侖珠單抗、替伊莫單抗替坦、阿達(dá)木單抗、奧馬佐單抗、托西莫單抗、I131托西莫單抗、依法利珠單抗、貝伐單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、那他珠他單抗、依那西普、IGN101、伏洛昔單抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、eraptuzumab、MDX-010、MDX-060、MDX-070、馬妥珠單抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、扎木單抗、阿德木單抗、奧戈伏單抗、尼妥珠單抗、ABT-874、地諾單抗、AM 108、AMG 714、芳妥珠單抗、達(dá)利珠單抗、高利單抗、CNTO 1275、奧瑞珠單抗、HuMax-CD20、貝利單抗、依帕珠單抗、MLN1202、維西珠單抗、托珠單抗、ocrerlizumab、培舍珠單抗、依庫(kù)麗單抗、培克珠單抗、阿昔單抗、蘭尼子木單抗、美泊利單抗和MYO-029。