[發明專利]用于進行多重PCR的方法

在審

• 申請號: 201780056599.2
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN109689889A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: I.科茨洛夫;A.古普塔;R.賽基;A.詹
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 任曉華;黃希貴

1.用于擴增和檢測樣品中的靶核酸的方法，其包括以下步驟：

(a) 使含有所述靶核酸的所述樣品在單個反應容器中與以下接觸：

(i) 一對寡核苷酸引物，每個寡核苷酸引物能夠與所述靶核酸的子序列的相反鏈雜交；

(ii) 寡核苷酸探針，其包含退火部分和標簽部分，其中所述標簽部分包含與靶核酸序列不互補的核苷酸序列或非核苷酸分子，其中所述退火部分包含與所述靶核酸序列至少部分互補的核苷酸序列，并雜交至由所述對寡核苷酸引物界定的所述靶核酸的所述子序列的部分，其中所述探針還包含相互作用的雙重標記，其包含位于所述標簽部分上或所述退火部分上的報告子部分和位于所述退火部分上的第一猝滅劑部分，并且其中通過核酸酶敏感的切割位點將所述報告子部分與所述第一猝滅劑部分分離；且其中所述標簽部分以溫度依賴性方式可逆地結合至猝滅分子，所述猝滅分子包含一個或多個猝滅劑部分或與一個或多個猝滅劑部分結合，當所述猝滅分子與所述標簽部分結合時，所述一個或多個猝滅劑部分能夠猝滅或在退火部分上的所述報告子部分；

(b) 使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通過PCR擴增所述靶核酸，使得在每個PCR循環的延伸步驟期間，聚合酶的核酸酶活性允許從探針的退火部分上的第一猝滅劑部分切割和分離標簽部分；

(c) 在猝滅分子與標簽部分結合的第一溫度下測量來自報告子部分的一個或多個信號；

(d) 在高于第一溫度的第二溫度下測量來自報告子部分的一個或多個信號，在所述第二溫度下猝滅分子不與標簽部分結合；

(e) 通過從在第二溫度下檢測到的一個或多個信號的中值或平均值減去在第一溫度下檢測到的一個或多個信號的中值或平均值，獲得計算信號值；由此，高于閾信號值的計算信號值允許確定靶核酸的存在。

2.權利要求1的方法，其中允許步驟(b)的PCR擴增達到超出擴增對數期的終點。

3.權利要求1的方法，其中所述報告子部分位于所述寡核苷酸探針的標簽部分上或所述寡核苷酸探針的退火部分上。

4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述標簽部分包含與靶核酸序列不互補的核苷酸序列，并且所述猝滅分子是包含與所述寡核苷酸探針的標簽部分至少部分互補的核苷酸序列的寡核苷酸，并通過雜交與所述標簽部分結合。

5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述標簽部分包含修飾，使得其不能被核酸聚合酶延伸。

6.前述權利要求中任一項的方法，其中所述寡核苷酸探針的標簽部分或所述猝滅分子或所述標簽部分和所述猝滅分子兩者含有一種或多種核苷酸修飾。

7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述一種或多種核苷酸修飾選自鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、橋連核酸(BNA)、2'-O烷基取代、L-對映體核苷酸，或其組合。

8.前述權利要求中任一項的方法，其中所述報告子部分是熒光染料，并且所述猝滅劑部分猝滅來自所述熒光染料的可檢測信號。