[發明專利]用于進行多重PCR的方法

在審

• 申請號: 201780056599.2
• 申請日: 2017-09-15
• 公開（公告）號: CN109689889A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: I.科茨洛夫;A.古普塔;R.賽基;A.詹
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 任曉華;黃希貴

本發明描述了使用標記的水解探針進行更高的多重PCR以檢測和定量靶核酸的方法。

發明領域

本發明涉及聚合酶鏈式反應(PCR)的方法，特別涉及進行多重PCR的方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(PCR)已成為生物醫學研究，疾病監測和診斷的普遍工具。通過PCR擴增核酸序列描述于美國專利號4,683,195、4,683,202和4,965,188中。PCR現在是本領域眾所周知的并且已在科學文獻中廣泛描述。參見PCR Applications, ((1999) Innis等人編輯，Academic Press, San Diego)；PCR Strategies, ((1995) Innis等人編輯，Academic Press, San Diego)；PCR Protocols, ((1990) Innis等人編輯，AcademicPress, San Diego)，和PCR Technology, ((1989) Erlich編輯，Stockton Press, NewYork)。

“實時”PCR測定能夠同時擴增和檢測并定量靶序列的起始量。典型實時PCR方案涉及使用對每種靶序列特異性的標記探針。探針優選用一個或多個熒光部分標記，所述熒光部分吸收并發射特定波長的光。在與靶序列或其擴增子雜交后，探針由于探針雜交或水解而表現出可檢測的熒光發射變化。

然而，PCR測定的主要挑戰仍然是分析單個管中的多種靶標的能力。在幾乎每個醫學和診斷領域，目標基因座數量迅速增加。例如，在法醫DNA概況分析，病原微生物檢測，多基因座遺傳疾病篩查和多基因表達研究(僅舉幾例)中，必須分析多個基因座。

使用大多數現有方法，多重測定的能力受到檢測儀器的限制。具體地，在相同反應中使用多個探針需要使用不同的熒光標記。為了同時檢測多個探針，儀器必須能夠區分每個探針發出的光信號。市場上的大多數現有技術不允許在同一反應容器中檢測超過四到七個單獨的波長。因此，每種靶標使用一個獨特標記的探針，在同一個容器中可以檢測到不超過四到七個單獨的靶標。在實踐中，至少一種靶標通常是對照核酸。因此，在實踐中，在同一管中可以檢測到不超過三到六個實驗靶標。由于光譜寬度，熒光染料的使用也受到限制，其中在可見光譜內僅可容納約六或七種染料而沒有顯著的重疊干涉。因此，除非進行擴增和檢測策略的根本改變，否則多重測定的能力將不能跟上臨床需要。

通過PCR后解鏈測定提供了使擴增反應多重化的額外能力。參見2006年6月23日提交的美國專利申請序列號11/474,071。在解鏈測定中，擴增的核酸通過其獨特的解鏈曲線來鑒定。解鏈測定包括測定雙鏈靶標或標記的探針和靶標之間的雙鏈體的解鏈溫度(解鏈點)。如美國專利號5,871,908中所述，為了使用熒光標記的探針確定解鏈溫度，在溫度受控程序中逐漸加熱(或冷卻)靶核酸和探針之間的雙鏈體。雙鏈體的解離改變了相互作用的熒光團之間或熒光團與猝滅劑之間的距離。相互作用的熒光團可以與分開的探針分子綴合，如美國專利號6,174,670中所述。或者，一個熒光團可以與探針綴合，而另一個熒光團可以插入核酸雙鏈體中，如美國專利號5,871,908中所述。作為又另一種替代方案，熒光團可以與單個探針寡核苷酸綴合。在雙鏈體解鏈后，熒光被猝滅，因為熒光團與猝滅劑在現在的單鏈探針中聚集在一起。

通過測量相關的熒光變化來監測核酸雙鏈體的解鏈。熒光的變化可以在稱為“解鏈曲線”的圖上表示。因為不同的探針-靶標雙鏈體可以設計成在不同溫度下解鏈(或再退火)，每個探針將產生獨特的解鏈曲線。正確設計的探針將具有與同一測定中其他探針的解鏈溫度明顯不同的解鏈溫度。許多現有的軟件工具使人們能夠在考慮這些目標的情況下設計用于同管多重測定的探針。例如，Visual OMP^TM軟件(DNA Software, Inc., Ann Arbor,Mich)使人們能夠確定核酸雙鏈體在各種反應條件下的解鏈溫度。