[發明專利]用于測量細胞中離子通道活性的組合物和方法

有效

• 申請號: 201780056078.7
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN109690317B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: D·比查姆;K·吉;A·盧卡維什尼科夫
• 申請（專利權）人: 生命科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C07D493/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶家蓉

描述用于檢測細胞中離子通道的活性的組合物和方法。所述方法包括向所述細胞提供上樣緩沖溶液，其中所述上樣緩沖液包括鉈離子指示劑和任選的氯離子，并向所述細胞提供包括鉈離子的刺激緩沖液。提供所述刺激緩沖液可使鉈離子通過所述離子通道流入或流出所述細胞。在提供所述刺激緩沖液后，檢測響應于鉈流入或流出的所述鉈離子指示劑的至少一種光學特性的變化，從而檢測所述離子通道的所述活性。

技術領域

描述了用于測量細胞中離子通道的活性的組合物、方法和試劑盒。

背景技術

鉈離子流入可用作負載有鈣離子指示劑苯并噻唑鈣乙酰氧基甲基(BTCAM)酯或鉈敏感性熒光染料的克隆細胞系中鉀離子通道活性的替代指示劑。目前用于監測鉀離子通道的測定使用鉈(I)離子，所述鉈(I)離子選擇性地進入開放的鉀通道并且與BTC結合，從而給出鉀離子通道活性的光學讀數。此方法可用于研究從化合物庫中以高通量篩選(HTS)模式測試的藥品對離子通道的激活和/或抑制。然而，基于結合到BTC的方法具有明顯的缺點。即，當在氯離子存在下執行測定時，鉈(I)離子形成氯化鉈(TlCl)，所述氯化鉈(TlCl)可溶性差并且將在約4.5mM或更大的濃度下從溶液中沉淀出來。因此，用于實施BTC的當前方法的緩沖液應基本上不含氯離子，以防止TlCl從溶液中沉淀出來以產生不一致的數據。因此，當前方法需要附加步驟：洗滌和去除緩沖液，其中細胞通常在培養物(例如，含有氯離子的緩沖液)中生長。此外，由于在這些測定中不存在氯化物，因此可將測定視為不接近生理條件。

作為BTC的替代方案，可使用對鉈離子的存在敏感的熒光染料來監測鉀離子通道和轉運體活性的HTS。在這種基于熒光的測定中報告的熒光信號可作為鉀離子通道或透過鉈離子的轉運體的活性的替代讀數。在此處，細胞負載有非熒光的鉈離子敏感染料。將待篩選的藥品與細胞預孵育，并將微板加載到讀數器中，其中它們被注射含有低水平鉈離子的刺激緩沖液。鉈離子自由地流動通過開放的鉀通道，充當K+的替代物。當刺激鉀通道時，鉈流動到細胞中并結合熒光染料，從而產生與生理鹽水條件下的通道活性成比例的熒光信號。然而，現有熒光染料面臨的問題是它們對于在HTS測定中檢測非常低水平的鉈(例如，低于約100-500μM)不夠靈敏。因此，需要改進的高度敏感的化合物，所述化合物即使在生理相關條件下的非常低的濃度下也能定量檢測鉈離子。另外，現有的熒光化合物發出通常在HTS測定中可干擾其它熒光組分(如例如綠色熒光蛋白)的光。因此，需要用于HTS測定的新熒光化合物，所述新熒光化合物在用于監測離子通道活性時響應于金屬離子(如鉈)的存在而在可見波長范圍上發出光。由于存在來自藥品庫中化合物的綠色自發熒光，還需要在FITC/綠色光學通道外部的傳感器。已知自發熒光遮擋和/或混淆在此通道中進行的測量。因此，需要在GFP/FITC通道外部吸收和發出光并提供有意義的反向屏的傳感器染料，所述反向屏用于證實在GFP/FITC屏中的“命中”以及發現潛在治療劑，否則所述潛在治療劑的活性被內在的綠色通道熒光掩蓋。

發明內容

在一個方面，提供用于檢測細胞中鉀離子通道的活性的方法，其包括：a)使細胞與上樣緩沖液接觸，其中細胞包含鉀離子通道，其中上樣緩沖液包含鉈離子指示符；b)向細胞施加刺激緩沖液，其中刺激緩沖液包含鉈離子，從而使鉈離子通過鉀離子通道流入細胞；和c)測量響應于鉈流入的鉈離子指示劑的至少一種光學特性的變化，從而檢測鉀離子通道的活性，其中鉈離子指示劑具有如以下表示結構：

其中R₂＝H，并且R₁＝

或其中R₁＝H并且R₂＝