[發明專利]用于病原性微生物檢測的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201780054148.5
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN109689882A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 野地博行;田端和仁
• 申請（專利權）人: 國立研究開發法人科學技術振興機構
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12M1/34;C12Q1/34;C12Q1/70;G01N33/483
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 曹陽

本發明作為能夠用于高靈敏度地檢測流感病毒等病原性微生物的技術，提供一種病原性微生物檢測方法，是檢測生物試樣中的病原性微生物的方法，該方法包括：導入步驟，向下層部與上層部之間的空間導入包含所述生物試樣、和成為存在于所述病原性微生物的表面或內部的酶所致的反應的底物的物質的親水性溶劑，所述下層部形成有能夠收容所述病原性微生物的多個收容部，所述上層部與該下層部的形成有該收容部的面相面對；封入步驟，向所述空間導入疏水性溶劑，在所述收容部內形成由疏水性溶劑包覆并且包含所述病原性微生物和所述物質的親水性溶劑的液滴；檢測步驟，以光學方式檢測因所述液滴中的所述酶與所述物質的反應而生成的反應產物，所述親水性溶劑具有大于所述反應產物的酸解離常數(pKa)的pH值。

技術領域

本發明涉及用于病原性微生物檢測的方法及試劑盒。更具體而言，涉及如下的方法等，即，在由疏水性溶劑包覆的親水性溶劑的極小容積中，以光學方式檢測病原性微生物的表面或內部的酶所致的反應的結果所生成的反應產物，由此進行病原性微生物的檢測。

背景技術

近年來，開發出使用了免疫層析法的簡便的流感病毒檢查試劑盒(參照專利文獻1)。使用免疫層析法的方法可以在數分鐘到數十分鐘之間檢測流感病毒，因此在感染的診斷、治療等中得到有效利用。

另外，以往，已知有基于作為流感病毒所具有的酶的神經氨酸酶(ノイラミニダーゼ)與顯色底物的反應而以光學方式檢測流感病毒的技術(參照專利文獻2、3)。作為顯色底物，例如使用4－甲基傘形酮基－α－D－神經氨酸(4－methylumbelliferyl－N－acetyl－α－D－neuraminic acid：4MU－NANA、參照專利文獻2)、4－烷氧基－N－乙酰神經氨酸或4，7－二烷氧基－N－乙酰神經氨酸的衍生物(參照專利文獻3)等。例如，在使用4MU－NANA作為顯色底物的方法中，通過基于神經氨酸酶的4MU－NANA的分解而生成作為熒光物質的4－甲基傘形酮。基于所生成的4－甲基傘形酮的量可以算出神經氨酸酶的酶活性值，進而基于酶活性值可以對流感病毒的粒子數進行定量。

與本發明相關聯，在非專利文獻1中，記載有如下的方法，即，液滴被油所包覆，使用能夠從外部直接接近液滴的飛升水平的液滴陣列，進行單分子酶測定。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開2008－275511號

專利文獻2：日本特開2011－139656號

專利文獻3：日本特表2002－541858號

非專利文獻

非專利文獻1：S.Sakakihara et al.，Lab Chip，2010，10，3355-3362。

發明內容

發明所要解決的問題

雖然基于上述的免疫層析法的流感病毒的檢測方法簡便，然而為了檢測需要10³～10⁴pfu/ml左右的病毒，有檢測靈敏度低的問題。

因而，本發明的主要目的在于，提供一種能夠用于高靈敏度地檢測流感病毒等病毒的技術。

用于解決問題的方法

為了解決上述的問題，本發明提供以下的[1]～[25]。

[1]一種方法，是檢測從感染了病原性微生物的對象或有感染的嫌疑的對象中分離出的生物試樣中的所述病原性微生物的方法，

該方法包括：