[發明專利]基于FraC actinoporin的用于生物聚合物傳感和測序的生物納米孔

在審

• 申請號: 201780052410.2
• 申請日: 2017-05-24
• 公開（公告）號: CN109890980A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 喬瓦尼·馬格里亞;卡斯滕·沃洛卡;納塔利·莉薩·瑪特爾;米莎·索斯金;黃剛
• 申請（專利權）人: 格羅寧根大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;B81B1/00;G01N33/487
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本發明大體上涉及納米孔及其在各種應用中的用途領域，例如生物聚合物和大分子的分析，通常通過在經納米孔遷移期間進行電測量。提供了一種包含漏斗形蛋白質納米孔的系統，所述納米孔包含α?螺旋成孔毒素，所述α?螺旋成孔毒素是來自actinoporin蛋白家族的成員，更特別的是Fragaceatoxin C(FraC)、突變型FraC、FraC旁系同源物或FraC同系物。

本發明大體上涉及納米孔及其在各種應用中的用途領域，例如生物聚合物和大分子的分析，通常通過在經納米孔遷移期間進行電測量。

納米孔代表了分析生物聚合物的有吸引力的方式，例如確定多肽或多核苷酸的身份，或估計聚合物中各個結構單元的身份以用于測序目的。這是因為該方法無標記物，提供了依賴于少量甚至單個分子的測量，并產生高度可縮放的電信號。

在利用納米孔的測量系統中，系統的一些性質取決于納米孔中的核苷酸，以及采用該性質的電測量。例如，通過將納米孔置于絕緣膜中并在多核苷酸的核苷酸存在下測量通過納米孔的電壓驅動的離子流來產生測量系統。

納米孔已成為單分子監測化學和酶促反應，蛋白質檢測和核酸測序的有效方法[1],[2]。已顯示Phi29[3]以及ClyA[4]允許雙鏈DNA的遷移。最近，使用aerolysin來區分由腺嘌呤組成但長度不同的均聚物[5]。迄今為止，僅顯示αHL和MspA能區分核酸。兩個納米孔在其跨膜區中具有β-折疊。當 DNA穿過MspA時，電流阻斷水平受到四個或更多核苷酸的影響[6]，而αHL 在其桶形結構中有三個傳感區，可容納約20個核堿基[7]。

本發明提供了具有不同結構和識別位點的新型納米孔，其提供了測序精確度的改進和/或提供不同的誤差分布。在這里，我們描述了Fragaceatoxin C(FraC)的純化和預寡聚化，Fragaceatoxin C是一種來自actinoporin蛋白家族的成員的α-螺旋成孔毒素，與鞘磷脂復合并重建成由1,2-二植烷酰-sn-甘油 -3-磷脂酰膽堿(DPhPC)組成的平面脂質雙層。本發明人進一步設計了一種 FraC突變體(例如ReFraC)，其允許ssDNA的捕獲和遷移以及區分用中性抗生物素蛋白(NA)固定的腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的均聚物。引人注目的是， dsDNA可以通過FraC遷移，很可能是經納米孔的彈性變形的α-螺旋收縮。

值得注意的是，發現FraC納米孔具有用于蛋白質測序和折疊蛋白質分析的理想形狀。在下文中顯示，電滲流是誘導蛋白質和多肽進入納米孔內的主導力。通過精確改造納米孔的收縮或通過改變溶液pH來調整納米孔的內表面，可以觀察到帶正電荷和帶負電荷的多肽的遷移。這是值得注意的，因為這表明在固定的施加電位下可以誘導足夠強的電滲流來運送正和負殘基。引人注目地發現是，一系列(未折疊的)不同大小的蛋白質，例如，在1.2-25kDa 范圍內的蛋白質，可以根據個體阻塞進行區分。使用20個氨基酸的模型多肽，證明甚至通過納米孔記錄可以觀察到單個氨基酸殘基的差異，表明FraC 納米孔允許鑒定遷移多肽中的特定序列特征。

此外，本發明人設計了一種在無鞘磷脂的平面脂質雙層中重構預寡聚化的FraC納米孔的方法。ReFraC納米孔被改造為允許電泳DNA捕獲并顯示 ssDNA均聚物之間的區別。與用于測序DNA的其他納米孔(例如αHL和 MspA)相反，FraC具有α-螺旋的V形跨膜區，這有利于微調核堿基辨別力。這是因為跨膜α-螺旋內不同位置的氨基酸取代可以調節收縮的大小和化學組成。

本文還顯示ReFraC誘導DNA雙鏈體在低施加電位下解鏈或允許它們在高施加電位下遷移。已經使用αHL納米孔研究了DNA發夾或更高階DNA 結構的解鏈[20],[21]。然而，ReFraC的順式孔腔(5.5nm)比αHL(2.6nm)[13] 或MspA(4.8nm)[22]的順式孔腔寬，表明FraC可以有利地用于研究較大的更高級的dsDNA結構，例如G-四鏈體，或折疊的RNA結構，例如tRNA。