[發明專利]無加帽步驟的硫醇化寡核苷酸的合成

有效

• 申請號: 201780051170.4
• 申請日: 2017-06-22
• 公開（公告）號: CN109689668B
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發明（設計）人: 石向林;楊紀民;W·F·吉斯曼;Y·費爾倫
• 申請（專利權）人: 比奧根MA公司
• 主分類號: C07H1/00
• 分類號: C07H1/00;C07H21/00
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;黃海波

本發明在此描述了一種用于制備硫醇化寡核苷酸的合成方法，所述合成方法無需加帽步驟，因為硫化劑使未反應的5’?OH基團加帽。

相關應用

本申請根據美國法典第35篇第119條(e)款要求2016年6月24日提交的美國臨時專利申請號62/354,433的權益，所述專利申請的全部內容特此以引用的方式并入。

序列表

本申請含有已以ASCII格式以電子方式提交且特此以引用的方式整體并入的序列表。創建于2017年6月20日的所述ASCII副本被命名為123429-00220_SL.txt并且大小為3,101個字節。

發明背景

寡核苷酸是可化學合成用于研究和醫學目的短DNA或RNA寡聚體。通常通過逐步添加核苷酸殘基以產生特定序列來制備寡核苷酸。硫醇化寡核苷酸的當前固相合成制造過程使用每個循環四個反應(即脫保護(例如，脫三苯甲基化)、偶聯、硫化和加帽)的重復。設計加帽步驟以阻斷在每個循環中未能與亞磷酰胺偶聯的任何未反應的5'-羥基，因此失敗序列不會進一步參與后續循環中的偶聯反應來產生缺失失敗偶聯的核苷的雜質。加帽步驟通常使用乙酸酐與堿催化劑，如吡啶或N-甲基嗎啉進行。

由于需要完成四個步驟中的每一個來將每個核苷酸添加至生長寡聚體，所以減少步驟的數量將減少每個核苷酸添加所需的時間的量以及減少完成寡核苷酸合成所需的試劑的量。因此，需要用于制備寡核苷酸的新的合成方法。

發明內容

本文中的本發明描述了一種使用每個循環三個反應(即脫三苯甲基化、偶聯和硫化)而不是常規的每個循環四個反應的重復用于完全或部分硫醇化的寡核苷酸的固相合成制造方法。

通常，通過將連接至固體載體的生長寡聚體的最后一個核苷酸的游離5'-羥基與適當的亞磷酰胺偶聯來將核苷酸添加至所述寡聚體鏈。偶聯反應的低效將使一些5'-羥基在后續偶聯反應中自由反應，從而產生缺失單個、但隨機核苷酸的寡聚體的復雜混合物。因此，為了防止未反應的5'-羥基稍后反應，在硫化步驟之前或之后，經由使用加帽試劑如乙酸酐來使5'-羥基加帽。

出人意料地，本發明人開發了一種消除在硫化步驟之前或之后的加帽步驟的方法。特別地，與其用需要新引入至所述方法的試劑(例如乙酸酐)使未反應的5'-羥基加帽，本發明人出人意料地發現，在硫化步驟中產生的副產物可用于使未反應的5'-羥基加帽。可使這些副產物，或在某些情況下硫化劑本身(例如PADS)再循環穿過固體載體以使未能與亞磷酰胺偶聯的5'-羥基加帽。未反應的5'羥基與硫化副產物反應，而無需單獨的加帽步驟，并且在后續循環中不再可用于偶聯。

對于完全硫醇化的寡核苷酸(即，一種僅包含硫代磷酸酯(–P＝S)鍵的寡核苷酸)，根本不需要加帽步驟，并且所述方法包括每個循環僅3個反應(脫保護、偶聯和硫化)。

本文所述的方法還可用于制備部分硫醇化的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯(–P＝S)鍵和磷酸二酯(-P＝O)鍵。部分硫醇化的寡核苷酸常規地通過4-反應步驟循環制備，所述循環中的第三步驟是氧化或硫化，這取決于是需要–P＝O鍵還是–P＝S鍵。使用本文所述的方法可用于消除硫化步驟后的加帽步驟。然而，因為氧化步驟的副產物不能使未反應的5'-羥基加帽，所以在氧化步驟之后可能剩余殘留量的未反應的5'-羥基。然而，對于包含少量–P＝O鍵(例如4個或更少)的部分硫醇化的寡核苷酸，在此所述的方法甚至可在氧化步驟之后沒有加帽步驟的情況下使用。對于包含更大量的–P＝O鍵(例如5個或更多)的部分硫醇化的寡核苷酸，可使用本文所述的方法，但是可在每個氧化步驟后使用常規加帽步驟(例如用乙酸酐)。然而，在硫化步驟之后仍然不需要加帽步驟，無論存在多少–P＝O鍵。

附圖說明

圖1是3-步寡核苷酸合成方法的圖。

圖2是常規4-步寡核苷酸合成方法的圖。應注意，硫化步驟可在常規的每個循環4個反應的方法中在加帽步驟之前或之后進行。