[發明專利]牛生殖細胞的冷凍保存用組合物和冷凍保存方法

有效

• 申請號: 201780051137.1
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN109688812B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 窪田力;安藤貴朗;玄丞烋;玄優基;今村修二;月精悟
• 申請（專利權）人: 博傲沃德株式會社
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/073;C12N5/076
• 代理公司: 北京五洲洋和知識產權代理事務所(普通合伙) 11387
• 代理人: 劉春成;劉春燕

本發明提供了一種牛精子等的牛生殖細胞的冷凍保存液以及冷凍保存方法。使用在生理溶液中溶解了0.3～0.9w/w％的對數均分子量為1000～20000的ε?聚賴氨酸的氨基的50～99％(摩爾)與琥珀酸酐發生反應而引入適當量的羧基的兩性高分子電解質(防凍聚氨基酸)和2～4w/w％的甘油的冷凍保存液。在冷凍保存方法的優選實施方式中，包括：用生理溶液將牛的精液稀釋至2.5～10倍，并在2～8℃保持的第一稀釋工序；以及保持在2～8℃的同時，通過點滴將添加有兩性高分子電解質(防凍聚氨基酸)和甘油的生理溶液添加到通過第一稀釋工序獲得的懸浮液中，進一步稀釋將牛的精液稀釋至5～20倍的第二稀釋工序。

技術領域

本發明涉及一種例如對于牛生殖細胞的冷凍保存有用的冷凍保存用組合物以及冷凍保存方法。

背景技術

為了長期保存動物的細胞或者組織，日常使用在0℃以下溫度的冷凍保存方法。然而，當動物的細胞或者組織包含水而進行冷凍時，由于在冷凍中水分子一邊排除溶質和混入物的介質一邊結晶化，形成僅由水分子形成的冰晶，因此在含水物中溶質和混入物的介質不均勻地擴散，而發生冷凍濃縮。

為了防止這種冷凍濃縮，進行了添加各種低分子化合物的方法。例如，在進行細胞的冷凍保存時，為了將冷凍保存中引起的因細胞內的結晶化對細胞造成的損害抑制到最低限度，進行了添加低分子的二甲基亞砜或甘油等作為冷凍保護劑的方法。

特別是，為了提高牛的子畜生產力，開發一種對牛生殖細胞有用的冷凍保存方法變得重要。

例如，作為用于冷凍牛精子的冷凍保護劑，已知有甘油。另外，作為用于冷凍牛卵子以及胚胎的冷凍保護劑，已知有甘油、乙二醇、丙二醇。進一步地，作為用于冷凍牛體細胞的冷凍保護劑，已知有二甲基亞砜。

然而，這些以往的冷凍保護劑無論哪一種都存在細胞毒性強這樣的問題。

同時，PCT/JP2009/002941(日本專利特許第5726525號)公開了一種包含在側鏈具有氨基和羧基的兩性高分子電解質的冷凍保存液。然而，尚不知該冷凍保存液能夠用于生殖細胞或體細胞等牛細胞的冷凍保存。

如上所述，為了提高牛的子畜生產力，開發一種對牛生殖細胞有用的新型冷凍保存劑以及冷凍保存方法變得重要。然而，以往的用于冷凍牛細胞的冷凍保護劑無論哪一種都存在細胞毒性強這樣的問題。

發明內容

因此，鑒于這些情況，本發明的目的在于提供一種對包含牛生殖細胞的牛細胞的冷凍有用的冷凍保存用組合物以及冷凍保存方法。

為了解決上述問題而進行廣泛研究的結果，發現通過將ε-聚賴氨酸(PLL)的氨基與琥珀酸酐反應而引入適當量羧基的兩性高分子電解質(防凍聚氨基酸)單獨使用或者與以往的冷凍保護劑合用，對牛生殖細胞或體細胞的冷凍保存有用，從而完成了本發明。

即，本發明包括以下。

一種牛精子等牛生殖細胞的冷凍保存用組合物以及使用該組合物的冷凍保存方法，其包含兩性高分子電解質(防凍聚氨基酸)和甘油，所述兩性高分子電解質(防凍聚氨基酸)包含由下式(I)所示的結構單元以及由下式(II)所示的結構單元，并且由下式(II)所示的結構單元的比例為50～99mol％。

＜化學式I＞

＜化學式II＞

發明效果

根據本發明，能夠提供一種對牛生殖細胞有用的冷凍保存用組合物，并且能夠提高牛的子畜生產力。另外，根據本發明，能夠提供一種對牛體細胞具有低毒性的冷凍保存用組合物。

附圖說明

圖1為表示將冷凍胚胎封入專用吸管的封入方式的圖。