[發明專利]水凝膠前體制劑及其用途

在審

• 申請號: 201780045912.2
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN109642207A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: S·里茲;J·圖阿蒂
• 申請（專利權）人: Q吉爾股份有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 郭廣迅;李渤

本發明涉及水凝膠前體制劑，其為未反應的粉末形式。其包含：活化酶，優選凝血酶；交聯酶，優選轉谷氨酰胺酶，更優選因子XIII轉谷氨酰胺酶，其中所述交聯酶在有或沒有緩沖劑的水中可被所述活化酶活化；和至少一種結構化合物A。所述結構化合物可通過所述交聯酶介導的選擇性反應交聯以形成水凝膠，其中所述交聯酶被活化。

本發明涉及根據獨立權利要求的前序部分的水凝膠前體制劑，用于制備水凝膠前體制劑的方法、試劑盒和用于制備水凝膠的方法。

已經認識到三維細胞培養支架實現了比在培養皿中的常規二維細胞培養更接近地模仿活生物體的基因表達和其他細胞活動的模式。

這導致了新的合成聚合物水凝膠家族的發展，其通常被稱為人工ECM(aECM)，因為它們模仿細胞外基質的許多方面。一個主要挑戰是提供實現基質在細胞或生物分子的存在下的交聯以及生物分子穩定地束縛到基質本身的化學。

近年來，開發了實現在細胞或生物分子的存在下形成凝膠的不同機制。例如，提出了基于低分子量結構單元，如肽(Estroff等人：Water gelation by small organicmolecules；Chem.Rev.2004；104(3)；1201-18)或脲基嘧啶酮(ureidopyrmimidinone)(Zhang S.：Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly；Nat.Bio-technol.2003；21(10)；1171-8)和中等分子量兩親性嵌段共聚物(例如參見Hartgerink等人：Peptide-amphiphile nonofibers：A versatile scaffold for thepreparation of self-assembling materials；Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.2002；99(8)；5133-8)的自組裝的機制。

可以基于位于水凝膠前體分子中的官能團的共價交聯，或者通過非酶促機制或者酶促機制制備水凝膠。酶促機制被定義成使得共價交聯由催化官能團之間的交聯反應的交聯酶介導。由凝血系統已知的交聯酶屬于例如轉谷氨酰胺酶類，其在鈣離子的存在下催化胺基，如蛋白-/肽-結合的賴氨酸和蛋白-/肽-結合的谷氨酰胺的酰基之間的異肽鍵的形成。轉谷氨酰胺酶的用途在過去適用于制備水凝膠。

例如，在Sanborn等人的“In situ cross-linking of a biomimetic peptide-PEG hydrogel via thermally triggered activation of factor XIII”(Biomaterials23(2002)，2703-2710)中公開了本領域已知的水凝膠。Sanborn等人使用鈣離子的控制釋放，通過熱觸發負載鈣的脂質體來活化hr因子(hrFactor)XIII。在鈣釋放時，凝膠組分通過hr因子XIII交聯。因此，整個凝膠系統可以在室溫下在水溶液中儲存，而沒有過早膠凝。

WO2014/180970A1公開了使用基于PEG的前體分子和凝血酶活化因子XIIIa制備水凝膠。由凍干粉末重新構成因子XIII，并用凝血酶在37℃下活化30分鐘。將活化的因子XIIIa的等分試樣儲存在-80℃下以供進一步使用。在含有50mM氯化鈣的Tris-緩沖液(TBS，50mM，pH 7.6)中制備形成水凝膠的前體溶液。通過添加凝血酶活化的因子XIIIa并劇烈混合引發交聯反應。該方法的一個缺點是在凝膠形成步驟之前分開進行因子XIIIa的活化。

因此，本發明的目的是避免已知的水凝膠前體制劑的缺點，并且具體是提供可再現地形成水凝膠的水凝膠前體制劑。該目的采用根據權利要求1所述的水凝膠前體制劑實現。