[發明專利]細胞培養裝置以及細胞培養方法

有效

• 申請號: 201780045603.5
• 申請日: 2017-06-12
• 公開（公告）號: CN109804057B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 保羅·維尤爾托;塞巴斯蒂安·約翰內斯·特里奇;阿瑙德·尼古拉斯
• 申請（專利權）人: 米梅塔斯私人有限公司
• 主分類號: C12M1/32
• 分類號: C12M1/32;C12M3/06;C12N5/071
• 代理公司: 北京三環同創知識產權代理有限公司 11349
• 代理人: 邵毓琴;李晶

本文描述了在微流體裝置上血管化細胞聚集體的方法、包括可灌注的血管網絡的微流體細胞培養裝置、試劑盒以及使用微流體細胞培養裝置的分析方法。所述微流體裝置包括一個或多個毛細管壓力屏障，其允許細胞外基質凝膠在網絡的限制區域內形成，在該細胞外基質凝膠中培養的細胞用于不同用途。

技術領域

本發明涉及一種用于對細胞進行3D培養的裝置和方法，例如，能夠對類器官分析和/或細胞培養物進行可控的且可靠的血管化和/或灌注的多孔板。同樣，本發明提供用于產生3D培養的細胞的方法和用于使培養的細胞的血管化/對培養的細胞進行灌注的方法，以及由該裝置和方法產生的分析板及其用途。

背景技術

近年來，在類器官培養領域，用于藥物檢測和疾病模擬的預測性表型模型取得了長足發展。類器官是三維的器官芽，通常包括同樣存在于人體內的大多數特化細胞。在實際使用中，在體外環境中模擬胚胎再生發育過程中的組織培養和分化使得干細胞分化為各種不同的分化的細胞。

這種類器官的一個眾所周知的例子是小腸類器官(Shoichi Date and ToshiroSato,Mini-Gut Organoids:Reconstitution of the Stem Cell Niche,Annu.Rev.CellDev.Biol.,2015,Vol.31:269-289)。生長因子和信號分子(例如，Wnt通路激動劑(例如Wnt3a、R-spondin、CHIR99021)、BMP/TGF通路抑制劑(例如Noggin)、EGF)的混合物以及基底膜提取物(基質膠或類似物)的環境確保了原代腸隱窩的培養、腸干細胞龕的維持以及細胞向例如杯狀細胞、腸上皮細胞和腸內分泌細胞分化的潛能。這樣就產生了具有二代腸形態特點的三維結構，包括隱窩和絨毛結構。已建立了類似的三維培養物用于原代人食管、胃、結腸、肝臟和胰腺的培養。

近來，在由誘導多能性干細胞生長腦類器官這一方面已取得進展。懸浮球體在連續振動條件下的長期培養產生了具有諸如前腦和后腦特征之類的特定部分的所謂的迷你腦[Cerebral organoids model human brain development and microcephaly,M.A.Lancaster,et al.Nature 2013,501,373–379]。最近，如下的腎小球培養方式已取得了突破性進展，該腎小球培養方式使用復雜的培養方案，在細胞遷移系統(transwellsystem)上從誘導多能性干細胞開始，這種腎小球的培養方式同樣產生了存在于人腎小球中的高度特化的細胞[Kidney organoids from human iPS cells contain multiplelineages and model human nephrogenesis,M.Takasato et al.,Nature 2015,526,564–568]。

類器官培養或更一般而言，3D細胞培養可以以多種方式進行。3D球體可以在所謂的懸掛式滴板(參見例如WO 2010/031194)或低粘附微量滴定板中形成。盡管據稱這些球體顯著提高了對標準細胞培養的預測性，但是它并不適用于大多數類器官培養。原因在于類器官通常需要細胞外基質成分，例如不存在于懸掛式滴板或低粘附板的球體中的基質膠(Matrigel)或膠原蛋白。同時，還開發了3D細胞培養模型，在該3D細胞培養模型中細胞生長嵌入至細胞外基質中的。這種方法增強了分化的功能的表達并改善了組織結構(Pampaloniet al.(2007).Nat Rev Mol Cell Biol 8:839-84)。

典型的類器官生長平臺包括標準培養皿、微量滴定板，在某些情況下還包括來自Corning的板。在這些情況下，類器官在細胞外基質(ECM)中或在涂有ECM的孔上生長。正如上面已經提到的，這些類器官缺乏血管，由此類器官生長超過一定尺寸會發生缺氧并在后期可能形成壞死核心，從而限制了類器官的生長。同時，由于內皮細胞向靶組織分泌重要因子，因此可以假設內皮細胞的存在對于向生理相關組織的發育是至關重要的。

微流體細胞培養是一項日益重要的技術，其在藥物篩選、組織培養、毒性篩選和生物學研究中得到應用。