[發明專利]含有Fc的蛋白的純化方法

有效

• 申請號: 201780045463.1
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN109563125B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: J.K.卡烏亞
• 申請（專利權）人: 美國安進公司
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;C07K1/34;C07K16/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;黃希貴

本發明涉及純化含有Fc區的蛋白，例如抗體和Fc融合蛋白的方法。特別地，本發明涉及一種導致聚集體蛋白水平降低的純化方法，所述方法包括將含有Fc區的蛋白吸附到溫度響應性蛋白A樹脂上，以及用洗脫緩沖液在低于約35C的溫度從所述樹脂中洗脫所述蛋白，所述洗脫緩沖液包含離液劑、糖醇、和至少一種氨基酸。還描述了使用洗脫緩沖液將完全組裝的抗體與其半抗體形式分離的方法。

相關申請的交叉引用

本申請要求2016年7月22日提交的美國臨時申請號62/365,943的權益，將其通過引用以其全部內容并入本文。

電子提交的文本文件的說明

本申請含有一份已經以ASCII格式電子提交的序列表并且將該序列表通過引用以其全部內容并入本文。2017年7月20日創建的序列表的計算機可讀格式副本命名為A-2036-WO-PCT_SeqList_ST25，并且大小為8.81千字節。

技術領域

本發明涉及生物藥劑制造領域。特別地，本發明涉及在純化操作過程中減少或防止含有Fc區的蛋白聚集的方法。本發明還涉及從難以去除的污染物(例如半抗體)中分離抗體的方法。

背景技術

聚集體仍然是基因工程化的生物制劑(特別是包含免疫球蛋白Fc區的融合蛋白，例如多特異性抗原結合蛋白)生產中的主要問題。蛋白聚集體由于其強烈的免疫原性而在治療藥物中是不可接受的(Maggio,Journal of Excipients and Food Chemicals[輔料與食品化學雜志],第3卷(2):45-53,2012；Sauerborn等人,Trends Pharmacol.Sci.[藥理科學趨勢],第31卷(2):53-59,2010)。由于培養基的充分通氣需要細胞培養物的劇烈振蕩，蛋白聚集體可以在蛋白的重組表達過程中發生(Vazquez-Rey和Lang,Biotechnology andBioengineering[生物技術和生物工程],第108卷(7):1494-1508,2011)。此外，許多蛋白易于解折疊，暴露于極端pH條件下(即pH9.0或pH4.5)，隨后發生聚集。包含免疫球蛋白Fc區的蛋白的典型純化方法需要用蛋白A親和樹脂捕獲蛋白，并且隨后用低pH酸性緩沖液(例如pH 2.7至3.7)從樹脂上洗脫(Hari等人,Biochemistry[生物化學],第49卷(43):9328–9338,2010；Ejima等人,PROTEINS:Structure,Function,and Bioinformatics[蛋白：結構、功能、和生物信息學],第66卷:954–962,2007)。低pH洗脫不僅誘導蛋白聚集，從而導致產率降低，而且還可能損害回收的非聚集蛋白的長期穩定性。

為了避免由對蛋白A樹脂進行低pH洗脫產生的不良效應，開發了溫度響應性蛋白A樹脂作為常規蛋白A樹脂的替代物。這種新樹脂由蛋白A的突變體形式組成，其在低于10℃的溫度與免疫球蛋白的Fc區結合，但在升高的溫度(例如40℃)對Fc區失去親和力(Koguma等人,Journal of Chromatography A[色譜學雜志A輯],第1305卷:149-153,2013)。最初，人們懷著極大的熱情接受了溫度響應性蛋白A樹脂，因為它允許通過簡單地加熱柱在中性pH下從樹脂中洗脫含有Fc區的蛋白(Koguma等人,Journal of Chromatography A[色譜學雜志A輯],第1305卷:149-153,2013)。雖然用溫度響應性蛋白A樹脂純化蛋白會產生穩定的分子，但這種方法是不切實際的，因為它需要從柱加載到洗脫使柱溫改變30℃或更高，因此在加載和洗脫步驟之間產生顯著的延遲時間。操縱柱溫需要的時間延遲為純化操作增加了大量的循環時間，從而使得這種方法對于大規模制造過程和在發現階段期間大組的蛋白的高通量純化而言都是不可取的。此外，大范圍溫度波動對從溫度響應性蛋白A樹脂洗脫的蛋白穩定性的影響仍然未知。

因此，本領域需要針對含有Fc區的蛋白的有效純化方法，所述方法使得對與先前蛋白A色譜法相關的蛋白的結構完整性的影響最小化或降低。

發明內容