[發明專利]細胞穿透肽(CPP)-介導的EV加載

在審

• 申請號: 201780043226.1
• 申請日: 2017-07-10
• 公開（公告）號: CN109689108A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: O.維克蘭德;P.倫丁;D.古普塔
• 申請（專利權）人: 醫福斯治療有限公司
• 主分類號: A61K47/50
• 分類號: A61K47/50
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 彭昶;黃希貴

本發明涉及用藥理學試劑加載細胞外囊泡(EV)的方法。本發明公開了使用非共價或共價加載方法將細胞穿透肽用作進入EV的載劑的用途。此外，本發明屬于醫學用途和包括此類藥理學試劑加載EV的組合物。

技術領域

本發明涉及用藥理學試劑加載細胞外囊泡(EV)的方法和此類EV用于治療目的的用途。

背景技術

細胞外囊泡(EV)通過將其內容物(主要是RNA、蛋白質和脂質)呈遞給靶組織中的受體細胞來調節正常生理學和病理學中的細胞間通信。已經在許多背景下研究了EV的修飾以摻入各種類型的藥理學試劑，例如WO2013/084000，其公開了外泌體用于細胞內遞送生物治療劑的用途，或WO2010/119256，其描述了使用外泌體遞送外源遺傳物質。

EV作為藥物遞送媒劑的效用在例如基于核酸的藥物(例如，siRNA)、靶向細胞內組分的基于大蛋白質的藥物以及例如溶解性差或高毒性藥理學試劑的情況下是不容置疑的。還已在一定程度上研究了用于更廣泛的藥理學試劑的EV介導的藥理學試劑遞送，例如WO2011/097480代表了用有機小分子化合物加載EV的典型方法。WO2011/097480描述了一種非常容易的方法，其中例如，依賴于藥物向EV內的擴散，使用簡單的共溫育步驟將植物化學試劑姜黃素和白藜蘆醇加載到EV中，在此期間，純化的EV和游離藥物(例如，姜黃素)在室溫下在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中一起溫育。雖然非常方便和直接，但將簡單的藥理學試劑加載到EV中的這種常規方法不是特別有效，導致藥理學試劑的顯著浪費，并且也非常難以控制。此外，它缺乏普遍適用性，因為一些藥理學試劑僅僅使用共溫育不會大量加載到EV中。其它人(例如，Fuhrman等人，《控釋雜志(J.Control Rel.)》，2015)也評估了EV的透化作用，使用洗滌劑(例如，皂苷)作為提高在這種情況下光活性試劑卟啉的加載效率的方法。

最近的專利申請(WO2015/120150)還涉及用各種類型的抗癌藥物(涵蓋小分子試劑和大生物藥劑)加載腫瘤來源的EV。然而，如本領域中通常的情況，關于如何加載外泌體的信息非常少，并且如果有可用的方法，它們很少用于載有藥理學試劑的EV的加載和實際治療應用。

發明內容

因此，本發明的一個目的是克服與將藥理學試劑加載到EV中以用于隨后的治療、預防和/或診斷應用相關的上述問題。此外，本發明旨在滿足本領域內的其它現有需求，例如以將大量藥理學試劑加載到EV中，實現可控加載，并且提供具有可觀的治療潛力的藥理學試劑加載EV。此外，本發明提供了一種將各種來源(小有機化合物、RNA治療劑、肽和蛋白質等)的藥理學試劑加載到EV中的普遍適用的策略，這是本領域所缺少的。

本發明通過利用細胞穿透肽(CPP)作為進入EV的藥理學試劑的載劑實現了這些和其它目的。在一個方面，本發明涉及用于EV加載的方法，其包括將EV群體暴露于至少一種藥理學試劑和至少一種CPP的步驟。藥理學試劑和CPP可以共價綴合成單一綴合物，其中一種CPP載有至少一種藥理學試劑。可替代地，CPP和藥理學試劑也可以由于非共價相互作用而形成納米顆粒復合物，所述非共價相互作用可以推測為例如疏水和/或靜電和/或范德華相互作用。有趣的是，盡管CPP-藥理學試劑綴合物可以以個體綴合物的形式存在，但它們也可以形成非共價納米顆粒復合物。如上所述，如本文使用的術語藥理學試劑囊括多種不同類型的分子，包含肽、基于核酸的試劑(例如，siRNA或mRNA)以及有機藥理學試劑。

在另一方面，本發明屬于通過加載EV源細胞用藥理學試劑加載EV的方法。此類方法可以包括以下步驟：(a)將EV源細胞群體暴露于至少一種藥理學試劑和至少一種CPP，和(b)收獲由EV源細胞產生的EV，其中EV包括所述藥理學試劑。

在某些情況下，根據本發明的加載方法可以有利地與電穿孔步驟組合，以便增加加載到EV中的藥物的量。