[發明專利]富集突變的無細胞核酸以供癌癥檢測的方法

在審

• 申請號: 201780042747.5
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN109415727A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 戈登·卡恩;亞歷克斯·阿爾法尼斯;阿拉什·詹姆席狄;瑞克·克勞斯納;理查德·拉瓦
• 申請（專利權）人: 格里爾公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6858
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

1.一種用于在一樣品中富集多種靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

提供一核酸內切酶系統；

其中所述多種靶核酸中的每一種包括一第一變體及一第二變體；

其中所述核酸內切酶系統包括：多種成簇規律間隔的常間短回文重復(CRISPR)核醣核酸序列(crRNA)或其衍生物，每一種crRNA包括一靶向序列；及多種CRISPR相關(Cas)的蛋白或其多種的變體，每一種Cas蛋白能夠結合到在一靶核酸上的一原型間隔相鄰基序(PAM)位點處；

其中每一種靶核酸的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；并且其中所述第二變體不包括所述PAM位點，或不包括相鄰于所述PAM位點且與所述crRNA靶向序列互補的所述區域，以及

使所述樣品接觸所述核酸內切酶系統，從而消耗所述第一變體并且富集在所述樣品中的所述多種靶核酸中的每一種的所述第二變體。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：每一種靶核酸中的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；以及所述第二變體不包括：所述PAM位點。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：每一種靶核酸中的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；以及所述第二變體不包括：相鄰于所述PAM位點且與所述crRNA靶向序列互補的所述區域。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于：每一種靶核酸的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；以及所述第二變體不包括與所述crRNA靶向序列互補的所述區域。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于,所述方法包括：擴增所述多種靶核酸的所述富集的第二變體，以生產一富集的序列文庫。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：定序所述富集的序列文庫以檢測在所述樣品中所述靶核酸的多個結構的重新排列或突變。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于：相較于所述樣品與所述內切核酸酶系統接觸之前的所述樣品中的所述第一變體的水平，在使所述樣品與所述核酸內切酶系統接觸之后的所述多種靶核酸中的每一種的所述第一變體消耗超過50％、超過60％、超過70％、超過80％、超過90％、超過95％、超過98％、超過99％、超過99.9％、超過99.99％或超過99.999％。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述多種靶核酸介于2種及100種之間、2種及80種之間、2種及60種之間、2種及40種之間、2種及20種之間、2種及10種靶核酸之間。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述多種靶核酸介于2種及100種之間，10種及100種之間，20種及100種之間，30種及100種之間，40種及100種之間，50種及100種之間，60種及100種之間，70種及100種之間，80種及100種之間或90種及100種之間的靶核酸。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述多種靶核酸中的每一種的所述第一變體在所述樣品中比所述第二變體豐富。

11.如權利要求1所述的方法，其特征在于：在所述樣品中的所述多種靶核酸中的每一種的所述第一變體包括：在所述樣品中的每一種所述靶核酸的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99％、至少99.9％、至少99.99％或至少99.999％。

12.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述多種靶核酸中的每一種的所述第一變體包括一野生型等位基因序列。