[發明專利]富集突變的無細胞核酸以供癌癥檢測的方法

在審

• 申請號: 201780042747.5
• 申請日: 2017-06-13
• 公開（公告）號: CN109415727A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 戈登·卡恩;亞歷克斯·阿爾法尼斯;阿拉什·詹姆席狄;瑞克·克勞斯納;理查德·拉瓦
• 申請（專利權）人: 格里爾公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6858
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

本發明提供了一種富集突變的無細胞核酸以供檢測及診斷癌癥的方法。本發明還提供了多種使用一CRISPR?Cas系統來靶向及消耗不需要的過多無細胞核酸序列從而富集不夠多的序列的方法。

相關申請

本申請主張2016年6月13日提交的美國臨時專利申請號62/349,514的申請日的優先權，所述申請的公開內容通過引用整體并入本文。本申請還主張2016年7月1日提交的美國臨時專利申請號62/357,812的申請日的優先權，所述申請的公開內容通過引用整體并入本文。

技術領域

本文提供多種富集突變的無細胞核酸(cell free nucleic acids)以供癌癥檢測及診斷的方法。本文還提供了多種使用一CRISPR-Cas系統靶向及消耗不需要的過多無細胞核酸序列從而富集不夠多的序列的方法。

背景技術

使用次世代定序(NGS)分析循環的無細胞核酸(例如：無細胞DNA(cfDNA)及/或無細胞RNA(cfRNA))被認為是用于檢測及診斷癌癥的一有價值的診斷工具。然而，在諸如一血漿樣品的一復雜樣品中，例如：來自一野生型等位基因(wild-type allele)的序列可能在cfDNA的NGS分析期間覆沒(overwhelm)一突變的等位基因的檢測。在另一個實例中，來自高度表達的基因的多種轉錄物可以在從cfRNA制備的一RNA-序列文庫的NGS分析期間覆沒不夠多的轉錄物的檢測。需要多種用于消耗不需要的過多的無細胞核酸序列及從一無細胞核酸群體富集突變的核酸序列以檢測及診斷癌癥的新方法。

發明內容

本發明的多個方面包括用于在一樣品中富集多種靶核酸(target nucleicacids)的方法，所述方法包括提供一核酸內切酶系統(endonuclease system)，其中所述多種靶核酸中的每一種包括一第一變體及一第二變體；其中所述核酸內切酶系統包括：多種成簇規律間隔的常間短回文重復(CRISPR)核醣核酸序列(crRNA)或其衍生物，每一種crRNA包括一靶向序列；及多種CRISPR相關(Cas)的蛋白或其多種的變體，每一種Cas蛋白能夠結合到在一靶核酸上的一原型間隔相鄰基序(PAM)位點處；其中每一種靶核酸的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；并且其中所述第二變體不包括所述PAM位點，或不包括相鄰于所述PAM位點且與所述crRNA靶向序列互補的所述區域，以及使所述樣品接觸所述核酸內切酶系統，從而消耗所述第一變體并且富集在所述樣品中的所述多種靶核酸中的每一種的所述第二變體。

在一些實施例中，每一種靶核酸中的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；以及所述第二變體不包括：所述PAM位點。在一些實施例中，每一種靶核酸中的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；以及所述第二變體不包括：相鄰于所述PAM位點且與所述crRNA靶向序列互補的所述區域。在一些實施例中，每一種靶核酸的所述第一變體包括：一PAM位點，所述PAM位點相鄰于與一crRNA靶向序列互補的一區域；以及所述第二變體不包括與所述crRNA靶向序列互補的所述區域。在一些實施例中，所述方法包括：擴增所述多種靶核酸的所述富集的第二變體，以生產一富集的序列文庫。在一些實施例中，所述方法包括：定序所述富集的序列文庫(sequencing library)以檢測在所述樣品中所述靶核酸的多個結構的重新排列或突變。