[發明專利]穩定的假型化慢病毒顆粒及其用途

有效

• 申請號: 201780033565.1
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN109563139B
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: A·嘉利
• 申請（專利權）人: 吉尼松公司;國家醫療保健研究所;埃夫里-瓦爾德艾松大學
• 主分類號: C07K14/155
• 分類號: C07K14/155;A61K35/17;A61P37/02;A61P31/00;A61P35/00;C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏;王月

本發明涉及一種獲得包含異源目標基因的穩定的假型化慢病毒顆粒的方法，包括以下步驟：a)在合適的細胞系中轉染至少一種質粒，其中所述至少一種質粒包含所述目標基因、rev、gag和pol基因和編碼ERV合胞素的序列，其中所述rev、gag和pol基因是逆轉錄病毒基因；b)孵育a)中獲得的轉染細胞，使得它們在上清液中產生所述穩定的假型化慢病毒顆粒；和c)收獲并濃縮b)中獲得的穩定的慢病毒顆粒。本發明還涉及一種用慢病毒載體轉導免疫細胞的方法，所述慢病毒載體用ERV合胞素糖蛋白假型化。該方法可在未刺激的血細胞或用IL7簡單刺激的細胞上進行，并且所述細胞可以繁殖。獲得的穩定的假型化慢病毒顆粒尤其可用于基因療法。

技術領域

本發明涉及穩定的假型化慢病毒顆粒及其用途，尤其是用于治療。本發明還涉及用于制備這種穩定的假型化慢病毒顆粒的方法。本發明還涉及在vectofusin存在下，用這種假型化慢病毒顆粒，優選以最小的或沒有預活化，轉導人外周血初始B細胞和單核細胞的體外方法。

背景技術

基因治療方法經常受到重組病毒載體對靶細胞的低轉導效率的阻礙。逆轉錄病毒載體，特別是基于人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒載體(LV)是用于基因療法的有希望的介質。這些載體目前在臨床應用中用于治療各種疾病，如免疫缺陷、神經退行性疾病或神經系統疾病、貧血或HIV感染。

逆轉錄病毒載體的一些應用依賴于特異性靶細胞的離體轉導，例如表達CD34標志物的淋巴細胞或造血干/祖細胞。LV用于轉導T淋巴細胞以產生長壽命的CAR-T細胞，用于治療癌癥，例如難治性慢性淋巴細胞白血病(CLL)(Porter等，Science Transl.Med.7:303ra139 2015)。LV用于轉導CD34+細胞用于遺傳起源的各種免疫、血液、代謝或神經退行性疾病的自體基因療法(Wagemaker G.HumGene Ther.2014Oct；25(10):862-5.doi:10.1089/hum.2014)。慢病毒載體是通用工具，其可以用各種病毒包膜糖蛋白假型化，從而賦予顆粒特定的細胞趨向性特征(Buchholz等Trends Biotechnol.2015Dec；33(12):777-90.doi:10.1016/j.tibtech.2015.09.008)。

使用重組慢病毒顆粒的一個限制因素是在重組慢病毒顆粒的生產過程中獲得高感染性滴度的能力。避免這種限制的一種方法是濃縮純化步驟中的病毒上清液。然而，取決于用于假型化病毒顆粒的包膜糖蛋白，對于一些LV難以建立純化方案。因此，許多慢病毒載體制劑具有低滴度且轉導效力有限。

另一個限制因素是難以轉導原代細胞，因此它們必須常常被活化以被轉導，從而失去其初始狀態。

最后，另一個限制因素是慢病毒載體本身感染靶細胞的能力。幾種包膜糖蛋白如VSV-G或RD114TR可用于假型化慢病毒載體，并且對靶細胞如CD34+細胞和原代血細胞具有可變的感染性。

合胞素是具有膜融合特性的內源性逆轉錄病毒(ERV合胞素)包膜糖蛋白(Dupressoir等,2005；Lavialle等,2013)。

專利申請EP2385058已經描述了由ERVW-1基因(ENSG00000242950；也稱為合胞素-1或HERV-W)編碼的人內源性逆轉錄病毒包膜糖蛋白的膜融合特性。所述申請描述了其通過形成合胞體在癌癥治療中的用途。